Хифф^™ Быстрая сотовая связь Direct Набор RT-qPCR на основе красителя SYBR Green подходит для извлечения РНК из всех видов клеток животных (таких как клетки клеточной стенки и суспензионные клетки, клетки первичной культуры, различные стволовые клетки, iPS-клетки и т. д.) без необходимости извлечения РНК и может использоваться непосредственно для анализа экспрессии qPCR, который является коротким, простым в использовании и имеет низкий уровень ошибок. Требуется всего 1,5 часа, чтобы завершить шаги от подготовки шаблона до реакции обратной транскрипции и анализа экспрессии гена.

В комплект входят реагенты для обратной транскрипции и детекции флуоресценции, которые можно использовать для анализа экспрессии генов без необходимости приобретения дополнительных реагентов.

Технические характеристики

Компоненты

Хранилище

Лизирующий буфер FCD и промывочный буфер FCD расплавляли и хранили при температуре 4°C для предотвращения загрязнения. Стоп-раствор FCD, ДНКаза I, 4× смесь Hifair™ FCD RT, 2× мастер-микс Hieff™ FCD qPCR SYBR следует хранить при температуре от -25 до -15 ℃.

Инструкции

1. Приготовление продуктов расщепления

1)1. Расплавьте реагент при комнатной температуре, переверните его вверх дном и осторожно перемешайте перед использованием, используйте после легкого центрифугирования, чтобы избежать пенообразования*.

*Неправильное смешивание реагентов, использование осциллятора для смешивания и неправильная настройка реагентов на льду могут привести к снижению эффективности реакции.

2)В зависимости от типа клеток** перенесите клетки в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 2 мин, чтобы собрать клетки и аспирировать среду. Если клетки культивируются в 96-луночных планшетах, среду можно аспирировать напрямую.

3) Добавьте 150 мкл промывочного буфера FCD в каждую лунку, промойте клетки продувкой, центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 2 мин и аспирируйте промывочный буфер FCD***.

4) Добавьте в каждую лунку 48 мкл раствора лизирующего буфера FCD и 2 мкл раствора ДНКазы Ⅰ, продуйте и перемешайте при комнатной температуре, затем дайте постоять 5 минут, а затем добавьте 2.5 мкл стоп-раствора FCD после инкубации****, а затем продуть и перемешать примерно 5 раз, чтобы получить продукт расщепления*****.

** Основное требование к количеству ячеек — 1 × 10⁴ клеток на лунку, и этот набор можно использовать в диапазоне 1 × 10³ - 1 × 10⁶ клетки. Если количество клеток больше, количество раствора лизирующего буфера FCD и раствора ДНКазыⅠ можно пропорционально увеличить по мере необходимости.

*** Условия центрифугирования различаются для разных клеток, поэтому центрифугируйте со скоростью, подходящей для используемых клеток.

**** Добавьте 2,5 мкл стоп-раствора FCD к 50 мкл лизата и при необходимости увеличьте количество стоп-раствора FCD.

***** Для длительного хранения растворов продуктов лизиса клеток храните при температуре -20°C.

5) Растопите 4 x Hifair™ FCD RT Mix при комнатной температуре и перемешайте, слегка переворачивая, поместите на лед и сконфигурируйте реакционную систему в соответствии с таблицей ниже:

*******Рекомендуемая дозировка — 2–5 мкл, старайтесь не превышать 45%.

1. Обратная транскрипция

Пипеткой аккуратно перемешайте приготовленный выше реакционный раствор и проведите реакцию обратной транскрипции в соответствии с процедурой, приведенной в таблице ниже:

* Рекомендуемая температура обратной транскрипции составляет 55°C. Для матриц с высоким содержанием GC или сложных матриц температура обратной транскрипции может быть увеличена до 60°C. Продукт обратной транскрипции может быть напрямую использован для обнаружения нижестоящей ОТ-ПЦР. Чтобы избежать ингибирования реакции ПЦР системой обратной транскрипции и получить соответствующее значение Ct (10-35), продукт можно разбавить в 10-1000 раз и затем использовать. Если нижестоящие эксперименты не проводятся в течение короткого времени, его можно хранить при температуре -20℃.

1. Количественная ПЦР с флуоресценцией

1) Реакция система конфигурация

Для приготовления реакционного раствора (приготовление на льду) рекомендуются следующие соотношения.

*Не добавляйте более 1/10 объема RT-qPCR продукта обратной транскрипции. Высокая концентрация матрицы легко приведет к неспецифической амплификации, подходящее разбавление в 5-50 раз. Рекомендуемое количество матрицы составляет 4 мкл, старайтесь не превышать 6 мкл. При плохой производительности реакции концентрацию праймера можно отрегулировать в диапазоне 0,2-1,0 мкмоль/л.

2) Процедура количественной ПЦР-амплификации флуоресценции (двухэтапный метод)

3) Процедура быстрой амплификации для флуоресцентной количественной ПЦР (двухэтапный метод)

* Температура отжига/расширения и конечное время расширения могут быть скорректированы соответствующим образом в соответствии с экспериментальными требованиями. Быстрая программа подходит для большинства генов, а стандартную программу можно попробовать для отдельных сложных генов вторичной структуры.

Примечания

1. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.
2. Для вашей безопасности работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.

Вер.EN20230908

Документы:

Руководства

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf