Хайфф NGS^ТМ OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 — это набор нового поколения для подготовки библиотек на основе ферментативной фрагментации. специально разработано и спроектировано для Иллюмина &MGI платформа секвенирования. По сравнению с традиционными методами построения библиотеки, этот продукт использует высококачественные ферменты фрагментации, устраняя громоздкий ультразвуковой процесс. Он упрощает операцию, объединяя модули фрагментации и восстановления концов в один. Кроме того, ферменты и буфер для модуля лигирования предварительно смешаны, что значительно сокращает время и стоимость построения библиотеки. Это делает его более подходящим для автоматизированного построения библиотеки. Этот набор для подготовки библиотеки имеет превосходную скорость преобразования библиотеки и применим для образцов всех распространенных животных, растений, микроорганизмов и т. д., а также для образцов FFPE. Разработанный на основе предыдущего поколения библиотечных конструкторов, этот продукт демонстрирует более высокую эффективность при фрагментации, репарация концов, dA-хвост и лигирование адаптеров, чем в предыдущих версиях. Высокоточный фермент значительно улучшает однородность и точность амплификации.

Технические характеристики

Компоненты

[Примечание]: Компоненты комплекта совместимы с обоими Иллюмина &МГИ платформа секвенирования, если полный адаптер был использован, Хайфф NGS^ТМ Необходима грунтовочная смесь (Yeasen Cat#12190 или Cat#12191).

Хранилище

Этот продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃. 1 год.

Примечания

1. О ходе операции

1. Пожалуйста, работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.，для вашей безопасности.

2. Разморозьте компоненты при комнатной температуре. После размораживания тщательно перемешайте содержимое пробирки встряхиванием, быстро встряхните ее и поместите на лед для дальнейшего использования.

3. При приготовлении реакционного раствора на каждом этапе рекомендуется использовать пипетку для тщательного перемешивания или осторожного встряхивания. Интенсивное встряхивание может привести к снижению выхода библиотеки.

4. Настоятельно рекомендуется использовать фильтрованные наконечники пипеток, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Обязательно меняйте наконечники пипеток при обработке разных образцов.

5. Неправильные операции с большой вероятностью могут привести к аэрозольным загрязнениям, что повлияет на точность результата. Рекомендуется обязательная физическая изоляция областей смешивания реакции ПЦР и областей анализа очистки продукта ПЦР. Оснащен оборудованием, таким как специализированные пипетки для создания библиотеки. Выполняйте обычную очистку для каждой области, протирая поверхности 0,5% гипохлоритом натрия или 10% отбеливателем

6. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

2. Фрагментация ДНК

1. Комплект совместим с 100 стр. - 1000 нг входной ДНК. Настоятельно рекомендуется использовать высококачественную входную ДНК с A260/A280 = 1,8-2,0.

2. На следующие эксперименты может повлиять, если высокие концентрации солей, таких как металл-хелатирующий агент, были введены с входной ДНК. Мы рекомендуем элюировать образец ДНК в ддх₂О для фрагментации.

3. Пожалуйста, обратитесь к таблице. 6 для времени фрагментации стандартных образцов ДНК. Набор имеет низкий уровень смещения фрагментации и обеспечивает равномерное покрытие ГХ для образцов ДНК с широким диапазоном составов ГХ. Пожалуйста, отрегулируйте время фрагментации в соответствии с вашими экспериментальными требованиями.

4. Для точной фрагментации готовьте реакцию на льду.

3. Лигирование адаптера

1. Клиентам доступны комплекты длинных адаптеров (адаптеров со штрих-кодом) Illumina или MGI, а также комплекты коротких адаптеров, которые они могут выбрать в соответствии со своими экспериментальными требованиями.

2. Рекомендуется выбирать высококачественные коммерческие адаптеры. Если вы выбираете адаптеры собственного изготовления, пожалуйста, доверьте это компании с опытом в синтезе праймеров NGS и отметьте необходимость строгого контроля загрязнения. Кроме того, рекомендуется готовить раствор для отжига ДНК в чистом помещении и использовать только один тип адаптера каждый раз, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.

3. Размораживайте адаптеры на льду или при температуре 4°C; при работе при комнатной температуре температура в лаборатории не должна превышать 25°C, чтобы предотвратить денатурацию адаптеров.

4. Качество и концентрация адаптеров напрямую влияют на эффективность лигирования и выход библиотеки. Слишком высокая концентрация адаптеров способствует образованию димера адаптера, в то время как слишком низкая концентрация адаптера снижает скорость лигирования и выход библиотеки. Соответствующие разбавления с буфером TE в соответствии с количеством входной ДНК при использовании адаптера.Таблица 1-2 перечислены рекомендуемые методы разбавления для обычных и UMI-адаптеров для различных количеств входной ДНК с использованием этого набора для платформ секвенирования Illumina или MGI.

Стол 1 Рекомендуемая Illumina количество адаптеров для разных входов ДНК

Стол 2 Рекомендуемый МГИ количество адаптеров для разных входов ДНК

4. Очистка ДНК с помощью гранул и выбор размера

1. Выбор размера ДНК может быть выполнен до репарации концов/добавления dA, после лигирования адаптера или после амплификации.

2. Рекомендуется проводить выбор размера сразу после лигирования адаптера, если количество вводимой ДНК превышает 50 нг; в противном случае, пожалуйста, выполните выбор размера после усиления.

3. Ligation Enhancer содержит высокую концентрацию ПЭГ, что может оказать существенное влияние на точность выбора размера. Таким образом, если выбор размера должен быть выполнен сразу после лигирования адаптера, настоятельно рекомендуется добавить этап очистки бусин перед выбором размера. Этап выбора размера может быть выполнен напрямую, если он выполняется до окончания ремонта/dA-tailing или после усиление библиотеки.

4. Перед использованием магнитные шарики следует выдержать при комнатной температуре, в противном случае выход снизится и повлияет на эффект выбора размера.

5. Перед использованием магнитные частицы следует тщательно перемешать с помощью вортекса или пипетки.

6. Не аспирируйте частицы при переносе супернатанта, даже следовые количества частиц могут повлиять на последующие реакции.

7. 80%-ный этанол должен быть свежеприготовленным, в противном случае это повлияет на эффективность восстановления.

8. Для точного подбора размера рекомендуется начинать с объема более 100 мкл. Если меньше, рекомендуется довести объем до 100 мкл сверхчистой водой.

9. Магнитные бусины следует высушить при комнатной температуре перед элюированием продукта. Недостаточная сухость легко может привести к тому, что остаточный этанол повлияет на последующие реакции; чрезмерная сухость приведет к растрескиванию магнитных бусинок и снижению выхода очистки. Обычно сушки при комнатной температуре в течение 3-5 минут достаточно, чтобы бусины полностью высохли.

10. При необходимости очищенные или отобранные по размеру образцы ДНК элюируются в 0.1× Буфер TE можно хранить при температуре 4°C в течение 1-2 недель или при температуре -20°C в течение месяца.

5. Усиление библиотеки

1. Проводить или нет амплификацию библиотеки зависит от количества входной ДНК, типов адаптеров, приложений данных секвенирования и т. д. Этап амплификации требуется при использовании частичных адаптеров. При использовании полноразмерных адаптеров, если входная ДНК < 200 нг, рекомендуется проводить амплификацию; в противном случае амплификация не требуется.

2. Число циклов амплификации должно строго контролироваться. Недостаточная амплификация может привести к низкому выходу библиотеки; Чрезмерная амплификация может привести к увеличению смещения, ошибок, дублированного чтения и химерных продуктов. Таблица 3 перечислены рекомендуемые числа циклов, ориентированные на выход библиотеки 1 мкг.

Стол 3 Рекомендуемое количество циклов для генерации 1000 нг выхода библиотеки

Примечание

1.Таблица 3 показывает количество параметров цикла с использованием высококачественных тестов входной ДНК размером около 200 п.н. Качество ДНК FFPE сильно варьируется, и если качество ДНК плохое или длина библиотеки большая, количество циклов необходимо соответствующим образом увеличить для получения достаточного количества библиотек.

2. Если в процессе построения библиотеки требуется выбор размера, рекомендуется использовать большее число циклов для усиления библиотеки; в противном случае рекомендуется меньшее число циклов.

3. Если используются неполные адаптеры, необходимо провести амплификацию не менее 2 циклов для формирования полного адаптера.

6. Анализ качества библиотеки

1. Качество созданных библиотек обычно анализируется путем измерения концентраций и распределений размеров.

2. Концентрации библиотек можно измерить с помощью флуоресцентных методов, таких как Qubit и PicoGreen, или количественной ПЦР.

3. НЕ рекомендуется использовать методы количественной оценки, основанные на поглощении, такие как NanoDrop.

4. Рекомендуется использовать метод qPCR для количественной оценки библиотеки: флуоресцентные методы, такие как Qubit и PicoGreen, не могут дифференцировать неполные структуры dsDNA (вставки без адаптера или только с одним из концов, лигированным с адаптером) от полных библиотек. Метод qPCR будет амплифицировать и измерять только полные библиотеки с обоими концами, лигированными с адаптерами (секвенируемые библиотеки), тем самым обеспечивая более точное измерение для загрузки.

5. Распределение размеров библиотек можно проанализировать с помощью Agilent Bioanalyzer или других устройств, основанных на принципах капиллярного электрофореза или микрофлюидики.

7. Другие материалы

1. Магнитные шарики для очистки ДНК: Hieff NGS^ТМ Бусины для отбора ДНК (Yeasen Cat#12601) или AMPure^® XP Beads (A63880) или другие эквивалентные продукты.

2.Адаптеры: Полный адаптер для Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Двойные капсюли CDI: Yeasen Кат. № 12412~Кат. № 12413; 384 уникальных праймера с двойным индексом (UDI): Йесен Номер кат. 12312~Номер кат. 12315; Адаптеры UMI UDI: Yeasen Кат. № 13370~Кат. № 13371; Полный адаптер для MGI: Yeasen Кат. № 13360-13362. Смесь ДНК-праймеров：Кат#12190 или Кат.№12191.

3. Анализ качества библиотеки: чип Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000/чип высокой чувствительности или другие эквивалентные продукты; количественные реагенты библиотеки.

4. Другие материалы: абсолютный этанол, стерильная сверхчистая вода, наконечники для пипеток с низкой степенью удержания, пробирки для ПЦР, магнитные стойки, термоциклер и т. д.

8. Рабочий процесс

Рисунок 1. Рабочий процесс OnePot Профи ДНК Комплект для подготовки к библиотеке

Цифры

Размеры фрагментов вставки, полученных при различных условиях фрагментации

Используя 500 нг стандартной ДНК в качестве матрицы, библиотеки были построены с помощью этого набора. Условия фрагментации были ферментативным расщеплением при 32°C, 35°C и 37°C в течение 5, 10, 15, 20 и 30 минут соответственно. Фрагментированные продукты были очищены с помощью 1,2x магнитных шариков и элюированы 21 мкл ddH₂O. Концентрация была измерена с помощью Qubit, а распределение восстановленных фрагментов вставки показано на следующем рисунке.

Рисунок 2. Профили библиотеки при 32°C для разного времени ферментативного переваривания

Рисунок 3. Библиотечные профили при 35 °C для разного времени ферментативного переваривания

Рисунок 4. Профили библиотеки при 37 °C для разного времени ферментативного переваривания