Набор Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit (на основе колонок) быстро преобразует неметилированные цитозины в образцах ДНК в урацил, оставляя метилированные цитозины неизменными. Во время высокотемпературной бисульфитной обработки двухцепочечная ДНК денатурирует в одинарные цепи. В присутствии HSO3- остатки цитозина подвергаются дезаминированию и преобразуются в урацил, при этом метилированные цитозины остаются неизменными. При последующей ПЦР-амплификации урацил заменяется тимином (T). Процесс преобразования занимает всего 5 минут, вмещая ввод ДНК в диапазоне от 100 пг до 2 мкг, и достигает эффективности преобразования ≥99% для неметилированных цитозинов. Конвертированная ДНК подходит для последующих применений, таких как ПЦР-амплификация и секвенирование NGS.

Особенность

Низкий входной сигнал: Подходит для преобразования образцов весом от 100 пг до 2 мкг.

Короткое время преобразования: примерно 5 минут.

Минимальное повреждение образца: Поддержание хорошей целостности образца после преобразования.

Высокая эффективность преобразования: Коэффициент конверсии ≥99%, высокие показатели конверсии в регионах с высоким содержанием GC при низком уровне ложноположительных результатов.

Подходит для редких образцов, например, конверсия метилирования ДНК отдельной клетки.

Возможность метилирования образцов РНК.

Продукт Компоненты

Примечание:

Для 10 тестов в коробке: добавьте 4,4 мл безводного этанола в моющий раствор.

Для 50 тестов в коробке: добавьте 22 мл безводного этанола в моющий раствор.

После добавления безводного этанола переверните и хорошо перемешайте, затем сохраните для будущего использования. Убедитесь, что крышка бутылки плотно закрыта, чтобы предотвратить испарение этанола, что может повлиять на эффективность реагента.

Фигура

Рисунок 4. Бисульфитная конверсия образцов геномной ДНК человека была выполнена с использованием как наборов для конверсии 12225, так и конкурирующего набора Q. Впоследствии для создания библиотек использовались наборы для подготовки специфичных для метилирования одноцепочечных библиотек ДНК. Данные по выходу библиотеки и контролю качества представлены выше. Результаты показывают, что при секвенировании объединенных библиотек из наборов 12225 и конкурирующего набора Q набор 12225 показал более высокий выход данных, более высокое отношение попадания в цель (%) и более низкие показатели дупликации (%).

Доставка и хранение

Раствор для преобразования 12225-A хранить при комнатной температуре, в защищенном от света месте. Хранить другие компоненты при комнатной температуре. Срок годности составляет 12 месяцев.

Примечание:

1. Для обеспечения успеха экспериментов на нисходящем этапе точно количественно оцените общее количество входной ДНК на этапе конверсии. Рекомендуется использовать Qubit 3.0/4.0 для количественной оценки ДНК с соотношением A260/A280 от 1,7 до 1,9. Диапазон входной ДНК должен быть от 100 пг до 2 мкг, с оптимальным диапазоном от 100 нг до 1 мкг. Недостаточный ввод ДНК может затруднить обнаружение на нисходящем этапе, в то время как чрезмерный ввод может снизить эффективность восстановления и конверсии.

2. Раствор преобразования, раствор десульфирования и промывочный раствор содержат летучие компоненты. После использования немедленно закрутите крышки и храните при комнатной температуре.

3. Для образцов после преобразования немедленно приступайте к последующим экспериментам. Для краткосрочного хранения храните при температуре -20°C, а для долгосрочного хранения храните при температуре -80°C.

4. В целях вашей безопасности и здоровья во время работы надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки.

5. Этот продукт предназначен только для исследовательских целей!

Инструкции

Подготовка реагентов и расходных материалов: Стерильная центрифужная пробирка 1,5 мл, вода без ферментов, абсолютный этанол, пробирка для ПЦР;

л Превращение бисульфита:

1) Подготовьте соответствующую стерильную пробирку для ПЦР в соответствии с количеством образцов, которые необходимо протестировать, и подготовьте реакционную систему в соответствии со следующей таблицей:

2) Система трансформации

Используйте пипетку, чтобы продуть и перемешать вышеуказанную систему, или встряхните и перемешивайте в течение 5 секунд, затем центрифугируйте в течение короткого времени и центрифугируйте реакционный раствор на дно пробирки для ПЦР.

в Примечание: 1. На данный момент общий объем реакционного раствора в пробирке ПЦР составляет 200 мкл. Для того чтобы сделать трансформацию более полной, реакционный раствор следует разделить на равные части и перенести в новую стерильную пробирку ПЦР после продувки и перемешивания на этапе 2), и следует запустить процедуру трансформации. После конверсии реакционные растворы в двух пробирках ПЦР объединяли в одну и ту же колонку очистки для очистки.

2. Если объем образца составляет от 20 до 40 мкл, уменьшите объем трансформирующего раствора, чтобы сохранить общий объем 200 мкл.

3. Если объем образца составляет 50 мкл, добавляют 150 мкл трансформирующего раствора, общий объем поддерживают на уровне 200 мкл, а время трансформации увеличивают до 6–10 мин.

3) Настройка программы преобразования КТ

Пробирка для ПЦР помещается в прибор для ПЦР с предварительно заданной программой для проведения реакции.

л Очищение

1) ТПеренесите 200 мкл конверсия решение для Пколонка мочеиспусканияс, центрифуга 30-60 с 13000 г, отбросить фильтрат и поместить колонку очистки в Струбка для сборас снова;

2) Добавьте 100 мкл Промывочный буфер в Очистительные колонны (убедитесь, что добавлен абсолютный этанол), центрифугируйте в течение 30-60 с 13000 г, отбросить фильтрат и поместить колонку очистки в Струбка для сборас снова;

3) Добавьте 200 мкл Буфер десульфирования в Очистительные колонны , и дать реакции постоять при комнатной температуре в течение 20 мин. После реакции центрифугировать в течение 30-60 с 13000 г, отбросьте фильтрат и поместите Очистительные колонны в Струбка для сборас снова;

4) Добавьте 200 мкл Промывочный буфер к Очистительные колонны, центрифуга 30-60 с 13000 г Слейте фильтрат и поместите Пколонка мочеиспусканияс в Струбка для сборас снова;

5) Повторите шаг 4) один раз;

6) Передача Очистительные колонны в подготовленную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 10-30 мкл Элюирующий буфер в центр мембраны фильтра после открытия крышки и сушки, и соберите ДНК после выдерживания в течение 1 мин при комнатной температуре и центрифугирования в течение 1 мин при 13000 г;

7) Хранить ДНК временно при -20 ℃. Для длительного хранения, пожалуйста, храните ДНК при -80 ℃ и избегать ненужного повторного замораживания и оттаивания.

Примечание: Очищенный продукт трансформации можно напрямую использовать в последующей реакции ПЦР или процессе секвенирования.

Руководство