Набор для совместной подготовки библиотеки ДНК и РНК Hieff NGS® В2 представляет собой набор ДНК и РНК совместной библиотеки для платформы секвенирования Illumina®&MGI®, который содержит эффективный реагент синтеза кДНК и реагент ферментативного расщепления. По сравнению с традиционной библиотекой строительство метод, этот продукт может эффективно завершить синтез кДНК и библиотеку ДНК и РНК строительство в одной пробирке. Набор содержит высококачественный фермент для фрагментации ДНК и объединяет фрагментацию ДНК, репарацию концов и добавление dA-хвоста в один этап, что значительно сокращает время и стоимость подготовки библиотеки. Этот набор для подготовки библиотеки имеет превосходную скорость преобразования библиотеки и применим для образцов всех обычных животных, растений, микроорганизмов и т. д., а также для образцов FFPE. Этот модернизированный набор с использованием новейшей оптимизированной лигазы значительно снижает скорость самолигирования во время лигирования адаптера. Более того, введение новой высокоточной полимеразы дополнительно улучшает однородность и точность амплификации.

Все компоненты, входящие в комплект, прошли строгий контроль качества и функциональную проверку, что в максимальной степени гарантирует стабильность и повторяемость конструкции библиотеки.

Технические характеристики

Компоненты

Примечание: * указывает на то, что данный реагент не входит в этот набор и требуются дополнительные реагенты.Набор является совместимо с двумя платформами Иллюмина^®&МГИ^®, но дополнительная грунтовочная смесь (CAT # 13334 Грунтовочная смесь для MGI^® и Кат. № 13335 Смесь грунтовок для Illumina^®) требуется.

Рабочий процесс:

Хранилище

Этот продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃. 1 год.

Примечания

О ходе операции

1. 1. Для вашей безопасности работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.
2. Разморозьте компоненты при комнатной температуре.После размораживания тщательно перемешайте содержимое пробирки встряхиванием, быстро встряхните ее и поместите на лед для дальнейшего использования.
3. Рекомендуется проводить каждый этап реакции в термоциклере с подогреваемой крышкой. Перед использованием термоциклер следует предварительно нагреть до заданной температуры.
4. Пожалуйста, используйте расходные материалы без РНКазы.загрязнение и очистка экспериментальной зоны регулярно. RNAZap от ThermoFisher^ТМ Для удаления загрязнений РНКазой был рекомендован высокоэффективный спрей для удаления нуклеиновых кислот.
5. Неправильные действия с большой долей вероятности могут привести к аэрозольным загрязнениям, что повлияет на точность результата.Рекомендуется обязательная физическая изоляция областей смешивания реакции ПЦР и областей анализа очистки продукта ПЦР. Оснащен оборудованием, таким как специализированные пипетки для построения библиотеки.
6. 6. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

Лигирование адаптера

1. Клиентам доступны комплекты длинных адаптеров (адаптеров со штрих-кодом) Illumina или MGI, а также комплекты коротких адаптеров, которые они могут выбрать в соответствии со своими экспериментальными требованиями.
2. Рекомендуется выбирать высококачественные коммерческие адаптеры. Если вы выбираете адаптеры собственного изготовления, пожалуйста, доверьте это компании с опытом в синтезе праймеров NGS и отметьте необходимость строгого контроля загрязнения. Кроме того, рекомендуется готовить раствор для отжига ДНК в чистом помещении и использовать только один тип адаптера каждый раз, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
3. Размораживайте адаптеры на льду или при температуре 4°C; при работе при комнатной температуре температура в лаборатории не должна превышать 25°C, чтобы предотвратить денатурацию адаптеров.
4. Концентрация адаптера напрямую влияет на эффективность лигирования и выход библиотеки. Объем адаптера, добавляемого в набор, фиксирован и составляет 5 мкл. Адаптеры рекомендуется разбавлять буфером 0,1×TE, а разбавленные адаптеры можно хранить при температуре 4°C в течение 48 часов. Таблица1 перечислено рекомендуемое количество адаптера для различного количества входной РНК.

Таблица 1-1 Рекомендуемая Illumina^® количество адаптеров для разных входов ДНК и РНК

Таблица 1-2 Рекомендуемый MGI^® количество адаптеров для разных входов ДНК и РНК

*Использование адаптера можно регулировать в соответствии с различными типами образцов общей РНК и количеством входного материала.

Усиление библиотеки

Число циклов амплификации должно строго контролироваться. Недостаточная амплификация может привести к низкому выходу библиотеки; Чрезмерная амплификация может привести к увеличению смещения, ошибок, дублированного чтения и химерных продуктов. Таблица 2 перечислены рекомендуемые числа циклов, ориентированные на выход библиотеки 1 мкг.

Стол 2 Рекомендуемое количество циклов для создания библиотеки ДНК и РНК *

Примечание：*Выход библиотеки зависит не только от входного количества и количества циклов амплификации, но также от качества образцов, условий фрагментации и условий сортировки. В процессе создания библиотеки выберите наиболее подходящие условия в соответствии с фактической ситуацией.

Очистка ДНК с помощью гранул и выбор размера

1. 1.В процессе построения библиотеки есть несколько этапов, которые требуют использования магнитных бусин для очистки ДНК. Мы рекомендуем использовать Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) или магнитные бусин AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) для очистки ДНК и выбора размера.
2. 2. Перед использованием магнитные шарики следует выдержать при комнатной температуре, в противном случае выход снизится и эффект выбора размера будет нарушен.
3. 3. Перед использованием магнитные частицы следует тщательно перемешать с помощью вортекса или пипетки.
4. 4. Не отсасывайте гранулы при переносе супернатанта, даже следовые количества гранул могут повлиять на последующие реакции.
5. 5. 80%-ный этанол должен быть свежеприготовленным, в противном случае это повлияет на эффективность восстановления.
6. 6. Магнитные бусины следует высушить при комнатной температуре перед элюированием продукта. Недостаточная сухость легко приведет к тому, что остаточный этанол повлияет на последующие реакции; чрезмерная сухость приведет к растрескиванию магнитных бусинок и снижению выхода очистки. Обычно сушки при комнатной температуре в течение 3-5 минут достаточно, чтобы бусины полностью высохли.
7. 7. При необходимости очищенные или отобранные по размеру образцы ДНК элюируются в1× Буфер TE можно хранить при температуре 4°C в течение 1-2 недель или при температуре -20°C в течение месяца.

Анализ качества библиотеки

1. Качество созданных библиотек обычно анализируется путем измерения концентраций и распределений размеров.
2. Концентрации библиотек можно измерить с помощью флуоресцентных методов, таких как Qubit и PicoGreen, или количественной ПЦР.
3. НЕ рекомендуется использовать методы количественной оценки, основанные на поглощении, такие как NanoDrop.
4. Рекомендуется использовать метод qPCR для количественной оценки библиотеки: флуоресцентные методы, такие как Qubit и PicoGreen, не могут дифференцировать неполные структуры dsDNA (вставки без адаптера или только с одним из концов, лигированным с адаптером) от полных библиотек. Метод qPCR будет амплифицировать и измерять только полные библиотеки с обоими концами, лигированными с адаптерами (секвенируемые библиотеки), тем самым обеспечивая более точное измерение для загрузки.
5. Распределение размеров библиотек можно проанализировать с помощью Agilent Bioanalyzer или других устройств, работающих на принципах капиллярного электрофореза или микрофлюидики.

Другие материалы

1. 1. Магнитные шарики для очистки ДНК: шарики для выделения ДНК Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) или AMPure^®XP Beads (A63880) или другие эквивалентные продукты.

2.Адаптеры: полный адаптер для Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 или другие эквивалентные продукты) или полный адаптер для MGI (Yeasen Cat#13360-13362 или другие эквивалентные продукты).

3. Анализ качества библиотеки: чип Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000/чип высокой чувствительности или другие эквивалентные продукты; количественные реагенты библиотеки.
4. Другие материалы: абсолютный этанол, стерильная сверхчистая вода, наконечники для пипеток с низкой степенью удержания, пробирки для ПЦР, магнитные стойки, термоциклер и т. д.

Документы:

Руководства

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf