Описание продукта

Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit — это полный набор для создания библиотеки секвенирования РНК для платформы секвенирования Illumina® и MGI®, включающий реагенты для фрагментации РНК, реагенты для обратной транскрипции, обычные и специфичные для цепи реагенты для синтеза ds-cDNA и реагенты для амплификации библиотеки. Библиотека секвенирования может быть создана с последующим набором для очистки мРНК или набором для удаления рРНК. Модуль двухцепочечного синтеза оснащен двумя буферами для удовлетворения потребности в обычной библиотеке или специфичной для цепи библиотеке. Среди них dTTP заменяется на dUTP в специфичном для цепи двухцепочечном буфере синтеза, поэтому dUTP можно добавлять ко второй цепи кДНК. Высокоточная ДНК-полимераза, используемая в этом наборе, не может амплифицировать ДНК-матрицу, содержащую урацил, что обеспечивает специфичность цепи. Все предоставленные реагенты прошли строгий контроль качества и функциональную проверку, что в максимальной степени гарантирует стабильность и воспроизводимость построения библиотеки.

Рабочий процесс

Компоненты продукта

Примечание: этот комплект совместим с платформами Illumina и MGI, но дополнительные возможности Illumina или МГИ Смесь грунтовок (кат. № 13335 Смесь грунтовок для Illumina) и Кат. № 13334 Смесь грунтовки для MGI ) является необходимый.

Доставка и хранение

Компоненты набора для подготовки двухрежимной мРНК-библиотеки Hieff NGS™ Ultima в коробке I поставляются с пакетами со льдом и могут храниться при температуре 2–8 °C в течение одного года.
Компоненты набора для подготовки библиотеки мРНК Hieff NGS™ Ultima Dual-mode в коробке II поставляются с сухим льдом и могут храниться при температуре -20 °C в течение одного года.

Предостережения

1 Операция
1.1 Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные халаты и одноразовые перчатки, при работе с этим продуктом. Этот продукт предназначен ТОЛЬКО для исследовательских целей!
1.2 Разморозьте компоненты при комнатной температуре. Тщательно перемешайте, переворачивая вверх-вниз несколько раз, быстро переверните и поместите на лед для использования.
1.3 Рекомендуется проводить каждую стадию реакции в термоциклере с подогреваемой крышкой. Термоциклер следует предварительно нагреть до установленной температуры перед использованием.
1.4 Необходимо использовать расходные материалы, не содержащие РНКазы, и регулярно проводить уборку экспериментальной зоны.
1.5 Неправильные операции с большой вероятностью могут привести к аэрозольным загрязнениям, что повлияет на точность результата. Рекомендуется обязательная физическая изоляция областей смешивания реакции ПЦР и областей анализа очистки продукта ПЦР. Оснащен оборудованием, таким как специализированные пипетки для создания библиотеки.
2. Лигирование адаптера
2.1 Клиентам доступны наборы длинных адаптеров Illumina или MGI (адаптеры со штрих-кодом) и наборы коротких адаптеров на выбор в соответствии с их экспериментальными требованиями.
2.2 Рекомендуется выбирать высококачественные коммерческие адаптеры. Если вы выбираете адаптеры собственного производства, пожалуйста, доверьте это компании, имеющей опыт в синтезе праймеров NGS, и укажите на необходимость строгого контроля загрязнения. Кроме того, рекомендуется готовить раствор для отжига ДНК в чистом помещении и использовать только один тип адаптера каждый раз, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
2.3 Размораживайте адаптеры на льду или при температуре 4°C; при работе при комнатной температуре температура в лаборатории не должна превышать 25°C, чтобы предотвратить денатурацию адаптеров.
2.4 Концентрация адаптера напрямую влияет на эффективность лигирования и выход библиотеки. Объем адаптера, добавляемого в набор, фиксирован и составляет 5 мкл. Адаптеры рекомендуется разбавлять буфером 0,1×TE, а разбавленные адаптеры можно хранить при температуре 4°C в течение 48 часов. В таблице 1 указано рекомендуемое количество адаптера для различного количества входной РНК.

Таблица 1-1 Рекомендуемое количество адаптеров Illumina для различных входных РНК

Таблица 1-2 Рекомендуемое количество адаптера MGI® для разной входной РНК

*Использование адаптера можно регулировать в соответствии с различными типами образцов общей РНК и количеством входного материала.

3. Усиление библиотеки

3.1 Высокоточная ДНК-полимераза, созданная на основе ДНК-полимеразы первого поколения, в наборе значительно улучшила однородность амплификации и не демонстрирует смещения амплификации.
3.2 Если индексированный адаптер (также известный как длинный адаптер или большой Y-адаптер) лигируется с целевой ДНК, смесь праймеров, предоставленная в этом наборе, может быть использована для амплификации; если для лигирования ДНК используется «короткий адаптер» или «маленький Y-адаптер», для амплификации необходимы индексные праймеры.
3.3 Количество циклов амплификации должно строго контролироваться. Недостаточная амплификация может привести к низкому выходу библиотеки; Чрезмерная амплификация может привести к увеличению смещения, ошибок, дублирования прочтений, химерных продуктов и накопления мутаций расширения. В таблице 2 перечислены рекомендуемые количества циклов для ПЦР-амплификации.

Таблица 2. Рекомендуемое количество циклов для создания библиотеки РНК*

Примечание:* Выход библиотеки зависит не только от входного количества и количества циклов амплификации. но также зависит от качества образцов, условий фрагментации и условий сортировки. В процессе создания библиотеки выберите наиболее подходящие условия в соответствии с фактической ситуацией.

4. Очистка ДНК с помощью гранул и выбор размера

4.1 В процессе построения библиотеки есть несколько этапов, которые требуют магнитных бусин для очистки ДНК. Мы рекомендуем Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) или магнитные бусины AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) для очистки ДНК и выбора размера.
4.2 Перед использованием магнитные шарики следует выдержать при комнатной температуре, в противном случае выход снизится и эффект отбора размера будет нарушен.
4.3 Перед использованием магнитные частицы следует тщательно перемешать с помощью вортекса или пипетки.
4.4 Не аспирируйте гранулы при переносе супернатанта, даже следовые количества гранул могут повлиять на последующие реакции.
4.5 80% этанол должен быть свежеприготовленным, в противном случае это повлияет на эффективность восстановления.
4.6 Магнитные бусины следует высушить при комнатной температуре перед элюированием продукта. Недостаточная сухость легко может привести к тому, что остаточный этанол повлияет на последующие реакции; чрезмерная сухость приведет к растрескиванию магнитных бусинок и снижению выхода очистки. Обычно сушки при комнатной температуре в течение 3-5 минут достаточно, чтобы бусины полностью высохли.
4.7 При необходимости очищенные или отобранные по размеру образцы ДНК, элюированные в буфере TE, можно хранить при температуре 4°C в течение 1-2 недель или при температуре -20°C в течение месяца.
5 Анализ качества библиотеки
5.1 Обычно качество созданной библиотеки можно оценить по распределению длин и обнаружению концентрации.
5.2 Определение концентрации библиотеки: методы, основанные на флуоресцентных красителях двухцепочечной ДНК, таких как Qubit®, PicoGreen® и т. д.; абсолютная количественная оценка, основанная на количественной ПЦР.
5.3 Методы, основанные на спектральном обнаружении, такие как NanoDrop® и т.п., неприменимы для обнаружения концентрации библиотеки.
5.4 qPCR рекомендуется для обнаружения концентрации библиотеки: через Qubit®, PicoGreen® и другие методы, основанные на двухцепочечных флуоресцентных красителях ДНК, он не может эффективно различать продукты, лигированные с адаптерами на одном конце, продукты, не лигированные с адаптерами на обоих концах, и другие неполные двухцепочечные продукты. Абсолютная количественная оценка qPCR основана на принципе амплификации ПЦР, которая количественно определяет только полную библиотеку адаптера на обоих концах образца (библиотеку, которая может быть секвенирована), исключая помехи несеквенирующих библиотек, которые не лигированы с адаптером ни на одноконцевых, ни на двухконцевых концах.
5.5 Определение распределения длин библиотек может быть выполнено с помощью Agilent Bioanalyzer 2100 и другого оборудования, основанного на принципе капиллярного электрофореза или микрофлюидики.

Документы:

Паспорт безопасности

12308-КОМПОНЕНТ A-MSDS-HB22803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ B-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ C-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ D-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ E-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ F-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ G-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ H-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ I-MSDS-HB220803.pdf

12308-КОМПОНЕНТ K-MSDS-HB220803.pdf

Руководства

12308ES-Hieff NGS™ Ultima Двухрежимный набор для подготовки РНК-библиотеки - Версия EN20230327.pdf

Цитаты и ссылки:

[1] Расшифровка микробиома кишечника белого амура с помощью мультиомического подхода
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou… - Микробиом, 2024 IF:19.4

[2] Объединенный скрининг CRISPR идентифицирует P-тела как репрессоры эпителиально-мезенхимального перехода рака
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang… - Исследования рака, 2024 IF:12.7

[3] Пептид 1, полученный из Klotho, подавляет клеточное старение в фиброзной почке, восстанавливая экспрессию Klotho посредством посттранскрипционной регуляции.
X Чжан, Л Ли, Х Тан, Х Хун, Ц Юань, ФФ Хоу… - Тераностика, 2024 IF:12.4

[4] Экзоскелетные частично покрытые стволовые клетки для восстановления инфаркта миокарда
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu… - Advanced Materials, 2023 IF: 29,4

[5] Геномные инновации и регуляторные изменения в ходе эволюции рода хлопчатника Gossypium
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang… - Nature Genetics, 2022 IF:41.379

[6] Аллели риска MTMR3 усиливают иммунитет IgA, вызванный Toll-подобным рецептором 9, при нефропатии IgA
И Ван, Т Ган, С Цюй, Л Сюй, И Ху, Л Лю, С Ши, Дж Лв… - Kidney International, 2023 IF: 19.6

[7] Раздельное дополнение базовых редакторов для минимизации нецелевых правок
X Сюн, К Лю, З Ли, ФН Ся, ХМ Жуань, Х Хэ, ДжФ Ли - Nature Plants, 2023 IF:18.6

[8] Сконструированные везикулы внешней мембраны бактерий, инкапсулирующие онколитические аденовирусы, повышают эффективность виротерапии рака за счет усиления аутофагии опухолевых клеток.
В. Бан, М. Сан, Х. Хуан, В. Хуан, С. Пан… - Nature Communications, 2023 IF:16.6

[9] Устойчивость раковых клеток к IFNγ может возникать из-за усиления активности пути восстановления двухцепочечных разрывов
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Исследования иммунологии рака, 2023 IF: 12.0

[10] Комбинированная терапия на основе двухцелевой биомиметической наносистемы доставки для преодоления резистентности к цисплатину при гепатоцеллюлярной карциноме
И Хуан, Ц Коу, И Су, Л Лу, X Ли, Х Цзян… - Журнал нанобиотехнологий, 2023 IF: 10,9

[11] PIAS3 способствует ферроптозу, регулируя TXNIP через сигнальный путь TGF-β в гепатоцеллюлярной карциноме
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Фармакологические исследования, 2023 IF:9.3

[12] Идентификация РНК-связывающих белковых мишеней с помощью HyperTRIBE в Saccharomyces cerevisiae
W Пяо, C Ли, П Сунь, М Ян, И Дин, W Сон… - Международный журнал молекулярной науки, 2023 IF:5.6

[13] Микробиота регулирует переход жизненного цикла и динамику нематоцитов у медуз
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao… - Iscience, 2023 IF: 5.08

[14] Профили транскриптома и микроРНК раскрывают регуляторную сеть и ключевые регуляторы формирования вторичной ксилемы у тополя «84K»
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - Международный журнал молекулярной науки, 2023 IF:5.6