Hieff NGS™ One Pot Flash DNA Library PrepKit — это быстрый набор для ферментативной ДНК-библиотеки.，ведьма содержит высококачественный фермент для фрагментации ДНК и объединяет фрагментацию ДНК, репарацию концов и добавление dA-хвоста в один этап, что значительно сокращает время и стоимость подготовки библиотеки.

Этот набор для подготовки библиотеки совместим с образцами от 100 пг до 500 нг всех распространенных животных, растений, микроорганизмов и т. д.

и быстро реализовать фрагментацию ДНК, репарацию терминалов и реакцию присоединения А-хвоста в одной пробирке. Набор должен быть согласован с адаптерами и праймерами и совместим с Illumina и МГИ высокопроизводительные платформы секвенирования.

Особенность

1) Подходит для образцов геномной ДНК весом от 100 пг до 500 нг.

2）совместимо с Illumina и МГИ высокопроизводительные платформы секвенирования.

3）Фрагментация, репарация концов и А-хвост реакция внутри 5 мин.

4）Эффективная скорость преобразования библиотеки и эффективность усиления.

Технические характеристики

Компоненты

Примечание: * указывает на то, что данный реагент не входит в этот набор и требуются дополнительные реагенты.Комплект является совместимо с двумя платформами Иллюмина и MGI, но дополнительная грунтовочная смесь (CAT # 13334 Грунтовочная смесь для MGI и требуется смесь грунтовок для Illumina (кат. № 13335).

Хранилище

Данный продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃ для 1 год.

Цифры

Рисунок 1. Выявление ДНК 10 видов микроорганизмов.

Библиотеки были подготовлены с использованием Кат#12316 протокол ,10 нг ДНК-стандарта микробного сообщества ZymoBIOMICS (Zymo Research® #D6306). Библиотеки были объединены и секвенированы на Illumina (SE75).Данные секвенирования были гомогенизированы до 20M и сравнили ожидаемый и обнаруженный состав для обоих входных уровней. Обнаружение специфической микробной геномной ДНК соответствовало ожидаемому составу. Ожидаемый состав: Cryptococcus neoformans 2%, Saccharomyces cerevisiae 2%, Bacillus subtilis 12%, Escherichia coli 12%, Enterococcus faecalis 12%, Lactobacillus fermentum 12%, Listeria monocytogenes 12%, Pseudomonas aeruginosa 12%, Staphylococcus aureus 12% и Salmonella enterica 12%.

О ходе операции

1. Пожалуйста, работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.，для вашей безопасности.

2. Разморозьте компоненты при комнатной температуре. После размораживания, тщательно перемешайте встряхиванием, быстро поверните пробирку в центрифуге и поместите ее на лед для дальнейшего использования.

3.При подготовке реакционного раствора на каждом этапе рекомендуется использовать пипетку для равномерного выдувания и перемешивания или осторожно встряхивать. Сильное встряхивание может привести к снижению выхода библиотеки.

4. Во избежание перекрестного загрязнения образцов рекомендуется использовать головку пистолета с фильтрующим элементом. Пожалуйста, заменяйте головку пистолета при абсорбции разных образцов.

5. Рекомендуется проводить каждый этап реакции в термоциклере с подогреваемой крышкой. Перед использованием термоциклер следует предварительно нагреть до заданной температуры.

6. Неправильные операции с большой вероятностью могут привести к аэрозольным загрязнениям, что повлияет на точность результата. Рекомендуется обязательная физическая изоляция областей смешивания реакции ПЦР и областей анализа очистки продукта ПЦР. Оснащен оборудованием, таким как специализированные пипетки для создания библиотеки.

7. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

О фрагментации ДНК

1. Совместимый диапазон этого набора составляет 100 пг.–500 нг входной ДНК. По возможности следует использовать высококачественную входную ДНК с A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Если входная ДНК содержит высокую концентрацию хелатирующего агента ионов металлов или других солей, это может повлиять на последующие эксперименты. Рекомендуется разбавить ДНК в ddH2O или Tebuffer (10 мМ трис-HCl, pH 8,0-8,5; 0,1 мМ ЭДТА).

3. Для большинства высококачественных геномных ДНК время переваривания показано в Таблице 1. Набор имеет низкую предпочтительность и может работать с различными шаблонами с содержанием GC.

Таблица 1. Рекомендуемое время традиционной геномной фрагментации ДНК

Лигирование адаптера

1. Концентрация адаптера напрямую влияет на эффективность лигирования и выход библиотеки. Чрезмерное использование адаптера может привести к большему количеству адаптердимера; Низкая дозировка может повлиять на перевязка эффективность и выход библиотеки. Таблицы 2 и 3 перечисляют рекомендуемое количество Адаптера для различных входов ДНК с использованием этого комплекта.

Таблица 2. Рекомендуемая Illumina количество адаптеров для разного входного количества ДНК

Таблица 3. Рекомендуемый MGI количество адаптеров для разного входного количества ДНК

Усиление библиотеки

Число циклов амплификации должно строго контролироваться. Недостаточная амплификация может привести к низкому выходу библиотеки; Чрезмерная амплификация может привести к увеличению смещения, ошибок, дублированного чтения и химерных продуктов. Таблица 4 перечисляет рекомендуемые номера циклов, ориентированные на выход библиотеки 1 μг.

Таблица 4. Рекомендуемые циклы 100 пг-500 нг входной ДНК

Очистка ДНК с помощью гранул и выбор размера

1. В процессе создания библиотеки есть несколько этапов, которые требуют очистки ДНК магнитными шариками. Мы рекомендуем Hieff NGS™ Бусины для отбора ДНК (Yeasen Cat#12601) или AMPure™ Магнитные частицы XP (Beckman Cat#A63880) для очистки ДНК и селекции по размеру.

2. Перед использованием магнитные шарики следует выдержать при комнатной температуре, в противном случае выход снизится и повлияет на эффект выбора размера.

3. Перед использованием магнитные частицы следует тщательно перемешать с помощью вортекса или пипетки.

4. Не аспирируйте частицы при переносе супернатанта, даже следовые количества частиц могут повлиять на последующие реакции.

5. 80%-ный этанол должен быть свежеприготовленным, в противном случае это повлияет на эффективность восстановления.

6. Магнитные бусины следует высушить при комнатной температуре перед элюированием продукта. Недостаточная сухость легко может привести к тому, что остаточный этанол повлияет на последующие реакции; чрезмерная сухость приведет к растрескиванию магнитных бусинок и снижению выхода очистки. Обычно сушки при комнатной температуре в течение 3-5 минут достаточно, чтобы бусины полностью высохли.

7. При необходимости очищенные или отобранные по размеру образцы ДНК элюируются в 0.1× Буфер TE можно хранить при температуре 4°C в течение 1-2 недель или при температуре -20°C в течение месяца.

Анализ качества библиотеки

1. Качество созданных библиотек обычно анализируется путем измерения концентраций и распределений размеров.

2. Концентрации библиотек можно измерить с помощью флуоресцентных методов, таких как Qubit и PicoGreen, или количественной ПЦР.

3. Не рекомендуется использовать методы количественной оценки, основанные на поглощении, такие как NanoDrop.

4. Рекомендуется использовать метод qPCR для количественной оценки библиотеки: флуоресцентные методы, такие как Qubit и PicoGreen, не могут дифференцировать неполные структуры dsDNA (вставки без адаптера или только с одним из концов, лигированным с адаптером) от полных библиотек. Метод qPCR будет амплифицировать и измерять только полные библиотеки с обоими концами, лигированными с адаптерами (секвенируемые библиотеки), тем самым обеспечивая более точное измерение для загрузки.

5. Распределение размеров библиотек можно проанализировать с помощью Agilent Bioanalyzer или других устройств, основанных на принципах капиллярного электрофореза или микрофлюидики.

Документы:

Паспорт безопасности

12316_MSDS_HB250211_EN.PDF

Руководства

12316_Руководство_Вер.EН20241225.pdf