Хайфф NGS^ТМ Набор для подготовки библиотеки РНК EvoMax (dUTP) — это предварительно смешанный, актиномицин D бесплатно и специфичный для нити общий Библиотека секвенирования РНК подготовка Комплект совместим с платформами Illumina и MGI. Этот продукт доступен в двух типах: трубка или комплект уплотнений, и этот комплект больше удобный будь то с помощью автоматизированного устройства для обработки жидкостей или ручная манипуляция . В набор входят реагенты для фрагментации РНК, реагенты для обратной транскрипции, реагенты для синтеза специфичных для цепи двуцепочечных ДНК и реагенты для амплификации библиотеки. Его можно связать с набором для очистки мРНК или набором для удаления рРНК, чтобы проводить исследования мРНК или lncRNA. Этот продукт оптимизирует модуль обратной транскрипции для получения библиотеки высокой специфичности цепи без актиномицина D, что в большей степени обеспечивает безопасность экспериментаторов. Все реагенты прошли строгий контроль качества и функциональную валидацию для максимальной стабильности и повторяемости библиотеки подготовка.

Технические характеристики

Компоненты

Примечание: * Обозначение указывает на то, что компонент не входит в комплект. Смесь праймера требуется, если используются полные адаптеры, в противном случае она не требуется.'т. Этот набор совместим с платформами Illumina и MGI, но требует дополнительной смеси праймеров (кат. № 13334 Смесь праймеров для MGI)^ТМ и № по каталогу 13335 Смесь праймеров для Illumina®) для платформы Illumina® или MGI, если используются полные адаптеры.

Фигура

Схема расположения группы реагентов пластины.

Рисунок 1: схема расположения реагентов в наборе библиотеки герметизирующих пластин

Рисунок 2. Упрощенные компоненты Набор для подготовки библиотеки РНК EvoMax.

Хранилище

Этот продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃. 1 годы.

Инструкции

1. Рекомендуемое количество для добавления в систему объемом 20 мкл составляет 0,1-1 единиц (U), и количество входных данных может быть скорректировано на основе фактических результатов.

2. В зависимости от требований эксперимента конечную концентрацию dUTP можно регулировать в пределах от 0,2 до 0,6 мМ, а 0,2 мМ dTTP можно добавлять выборочно.

3. Время реакции при 25~37℃ можно отрегулировать в течение 5–10 минут в соответствии с экспериментальными требованиями.

Примечания

1. Операция

1) Пожалуйста, работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.，для вашей безопасности.

2) Разморозьте компоненты при комнатной температуре. Тщательно перемешайте, переворачивая вверх-вниз несколько раз, быстро переверните и поместите на лед для использования.

3) Рекомендуется проводить каждую стадию реакции в термоциклере с подогреваемой крышкой. Термоциклер следует предварительно нагреть до установленной температуры перед использованием.

4) Необходимы расходные материалы, свободные от загрязнения РНКазой, и регулярная уборка экспериментальной зоны. RNAZap от ThermoFisher^ТМ Для удаления загрязнений РНКазой был рекомендован высокоэффективный спрей для удаления нуклеиновых кислот.

5) Неправильные операции с большой вероятностью могут привести к аэрозольным загрязнениям, что повлияет на точность результата. Рекомендуется обязательная физическая изоляция областей смешивания реакции ПЦР и областей анализа очистки продукта ПЦР. Оснащен оборудованием, таким как специализированные пипетки для создания библиотек.

6) Данный реагент предназначен для одноразового использования. Многократное использование строго запрещено.

7) Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

2. Лигирование адаптера

1) Клиентам доступны комплекты длинных адаптеров (адаптеров со штрих-кодом) Illumina или MGI, а также комплекты коротких адаптеров, которые они могут выбрать в соответствии со своими экспериментальными требованиями.

2) Рекомендуется выбирать высококачественные коммерческие адаптеры. Если вы выбираете адаптеры собственного изготовления, пожалуйста, доверьте это компании с опытом в синтезе праймеров NGS и отметьте необходимость строгого контроля загрязнения. Кроме того, рекомендуется готовить раствор для отжига ДНК в чистом помещении и использовать только один тип адаптера каждый раз, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.

3) Размораживайте адаптеры на льду или при температуре 4°C; при работе при комнатной температуре температура в лаборатории не должна превышать 25°C, чтобы предотвратить денатурацию адаптеров.

4) Концентрация адаптера напрямую влияет на эффективность лигирования и выход библиотеки. Объем адаптера, добавленного в набор, фиксирован на 5 мкл. Адаптеры рекомендуется разбавлять буфером 0,1×TE, а разбавленные адаптеры можно хранить при температуре 4°C в течение 48 часов. Таблица 1 перечислено рекомендуемое количество адаптера для различного количества входной РНК.

Таблица 1-1 Рекомендуемое количество адаптеров Illumina для различных входных РНК

Таблица 1-2 Рекомендуемое количество адаптера MGI для разной входной РНК

* Использование адаптера можно регулировать в зависимости от различных типов образцов общей РНК и количества входного материала.

3.Усиление библиотеки

1) Высокоточная ДНК-полимераза, созданная на основе ДНК-полимеразы первого поколения, в наборе значительно улучшила однородность амплификации и не демонстрирует смещения амплификации.

2) Число циклов амплификации должно строго контролироваться. Недостаточная амплификация может привести к низкому выходу библиотеки; Чрезмерная амплификация может привести к увеличению смещения, ошибок, дублирования прочтений, химерных продуктов и накопления мутаций расширения. В таблице 2 приведены рекомендуемые номера циклов ПЦР-амплификации.

3) Рекомендуемое количество циклов, указанное в Таблице 2, может удовлетворить подавляющее большинство требований к подготовке библиотеки. Если ваш образец низкого качества (например, образцы FFPE с серьезной деградацией), количество циклов можно увеличить соответствующим образом в соответствии с фактической ситуацией. Обратите внимание, что мРНК различается у разных видов и тканей, количество циклов амплификации следует скорректировать.

Таблица 2. Вводные данные. Общий объем РНК и рекомендуемые циклы амплификации. Таблица *

[Примечание]: *Выход библиотеки зависит не только от входного количества и количества циклов амплификации, но также от качества образцов, условий фрагментации и условий сортировки. В процессе построения библиотеки выбирайте наиболее подходящие условия в соответствии с фактической ситуацией.

4. Очистка ДНК с помощью гранул и выбор размера

1) В процессе построения библиотеки есть несколько этапов, которые требуют использования магнитных бусин для очистки ДНК. Мы рекомендуем использовать Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) или магнитные бусины AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) для очистки ДНК и выбора размера.

2) Перед использованием магнитную бусину следует нагреть до комнатной температуры, в противном случае урожайность снизится, и эффект выбора размера будет нарушен.

3) Перед использованием магнитные частицы следует тщательно перемешать с помощью вортекса или пипетки.

4) Не аспирируйте частицы при переносе супернатанта, даже следовые количества частиц могут повлиять на последующие реакции.

5) 80%-ный этанол должен быть свежеприготовленным, в противном случае это повлияет на эффективность восстановления.

6) Магнитные бусины следует высушить при комнатной температуре перед элюированием продукта. Недостаточная сухость легко может привести к тому, что остаточный этанол повлияет на последующие реакции; чрезмерная сухость приведет к растрескиванию магнитных бусинок и снижению выхода очистки. Обычно сушки при комнатной температуре в течение 3-5 минут достаточно, чтобы бусины полностью высохли.

7) При необходимости очищенные или отобранные по размеру образцы ДНК, элюированные в буфере TE, можно хранить при температуре 4°C в течение 1–2 недель или при температуре -20°C в течение месяца.

5.Анализ качества библиотеки

Как правило, качество созданной библиотеки можно оценить путем определения концентрации и распределения по длине.

6. Другие материалы

1) Набор для обогащения мРНК: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).

2) Набор для удаления рРНК: набор для удаления рРНК человека Hieff NGS® MaxUp (рРНК и ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) или другой набор для удаления рРНК.

3) Очистка РНК магнитных частиц: очиститель РНК Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12602) или другие эквивалентные продукты.

4) Магнитные шарики для очищенной ДНК: шарики для выделения ДНК Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12601) или шарики AMPure® XP (A63880) или другие эквивалентные продукты.

5) Контроль качества РНК: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip или другие эквивалентные продукты.

6) Адаптеры: полный адаптер для использования Illumina® (кат. № 13519-13520 или другой эквивалент) или полный адаптер для использования MGI® (кат. № 13360-13362 или другой эквивалент).

7. Проверка качества библиотеки

Чип Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 / чип высокой чувствительности или другие эквивалентные продукты; реагенты для количественного анализа библиотеки.

8. Другие материалы

Безводный этанол, стерильная сверхчистая вода, головка пистолета с низкой адсорбцией, пробирка для ПЦР, магнитная рамка, инструмент для ПЦР и т. д.

Схема потока

Рисунок 1: Процесс создания библиотеки РНК

Подготовка библиотеки РНК для образцов FFPE разного качества

Для сильно деградировавшей FFPE-РНК (DV 200 <50%) и образцов с низким входным объемом мы рекомендуем протокол двойной очистки после лигирования адаптера, чтобы сократить потери библиотеки.

Пиковые паттерны образцов FFPE разного качества