Зонд для истощения мРНК глобина (человек) предназначен для удаления человеческой глобиновой мРНК. Он может эффективно удалять глобиновую мРНК у взрослых, младенцев и эмбрионовник Источники, включая HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 и HBZ. Этот продукт используется с Hieff NGS^ТМ Набор MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen#12253) для эффективного удаления рРНК и мРНК глобина из общей РНК. Этот набор подходит как для неповрежденных, так и для деградированных образцов РНК. Образцы РНК после удаления рРНК и мРНК глобина можно использовать для высокопроизводительного секвенирования мРНК и некодирующей РНК, что значительно увеличивает долю достоверных данных в результатах секвенирования, а также синтеза кДНК или других последующих приложений.

Применение продукта

Подходит для образцов общей РНК человека от 100 нг до 1 мкг., ресурс крови мышей и крыс, а также для образцов как неповрежденной, так и частично деградировавшей РНК.

Компоненты продукта

Доставка и хранение

Все компоненты поставляются с сухим льдом и могут храниться при температуре -20°C в течение одного года..

Фигура

Всего 500 нг и 100 нг общей РНК крови человека подверглись удалению рРНК и комбинированному удалению рРНК и глобина соответственно. После построения библиотеки и секвенирования было сравнено содержание мРНК глобина.

Предостережения

1. Пожалуйста, используйте расходные материалы, не содержащие РНКазы, и регулярно очищайте экспериментальную зону. Рекомендуется использовать RNAZap от ThermoFisher^ТМ высокоэффективный спрей для удаления нуклеиновых кислот, удаляющий загрязнения РНКазой.

2. Образец РНК не должен содержать геномной ДНК-контаминации. Если в образце осталась гДНК, ее следует расщепить ДНКазой I и очистить перед использованием.

3. Максимальный объем вводимого образца РНК составляет 10 мкл. Если объем образца большой, его можно сначала сконцентрировать.

4. Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки во время работы.

5. Только для исследовательских целей!

Инструкции

1. Гибридизация зонда с РНК

1.1 Разбавьте 10 нг–1 мкг общей РНК водой без нуклеазы до конечного объема 10 мкл в пробирке для ПЦР. Сохраните РНК на льду.

1.2 Собрать следующая реакция гибридизации РНК/зонда на льду согласно Таблице 1.

Таблица 1 Реакция гибридизации РНК/зонда

1.3 Тщательно перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз. Быстро опустите пробирку в микроцентрифугу, чтобы собрать жидкость со стенок пробирки.

1.4 Поместите пробирку в термоциклер и запустите следующую программу, указанную в Таблице 2, с нагретой крышкой, установленной на 105°C.

Таблица 2 Программа реакции гибридизации РНК/зонда

2. Расщепление РНКазой H

2.1 Соберите следующую реакцию расщепления РНКазой H: на льду согласно таблице 3.

Таблица 3 Реакция переваривания РНКазой H

2.2 Тщательно перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз. Быстро опустите пробирку в микроцентрифугу, чтобы собрать жидкость со стенок пробирки.

2.3 Поместите пробирку в термоциклер и запустите следующую программу: крышка 50°С; 37°С, 30 мин; 4°С, держать.

3. ДНКаза я Пищеварение

3.1 Соберите следующую реакцию расщепления ДНКазой I на льду в соответствии с таблицей 4.

Таблица 4 Реакция переваривания ДНКазой Ⅰ

3.2 Тщательно перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз. Быстро опустите пробирку в микроцентрифугу, чтобы собрать жидкость со стенок пробирки.

3.3 Поместите пробирку в термоциклер и запустите следующую программу: крышка снята; 37°С, 30 мин; 4°С, держать.

4. Очистка РНК

4.1 Уравновешивание Hieff NGS^ТМОчиститель РНК (кат. № 12602) до комнатной температуры и тщательно ресуспендируйте гранулы путем встряхивания перед использованием.

4.2 Добавить 110 мкл (2,2×) Добавьте гранулы в раствор РНК из шага 3.3 и тщательно перемешайте, пипетируя не менее 10 раз.

4.3 Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут для связывания РНК с гранулами.

4.4 Поместите пробирку на магнитный штатив, чтобы отделить гранулы от супернатанта. Когда раствор станет прозрачным (примерно через 3 минуты), слейте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не коснуться бусин кончиками пипеток.

4.5 Держите пробирку на магнитном штативе. Добавьте в пробирку 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 секунд, затем слейте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не коснуться бусин кончиками пипеток.

4.6 Повторите шаг 4.5 один раз, всего для двух промываний.

4.7 Удалите остаточный этанол с помощью 10 мкл - наконечники пипеток. Поместите пробирку на магнитный штатив и дайте гранулам высохнуть на воздухе в течение 5 минут с открытой крышкой.

4.8 Снимите пробирку с магнитного штатива. Элюируйте РНК из гранул, добавив 11 мкл воды, свободной от нуклеазы. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз, и быстро вращайте пробирку.

4.9 Инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Поместите пробирку на магнитный штатив, пока раствор не станет прозрачным (~ 3 минуты).

4.10 Перенесите 10 мкл супернатанта в пробирку, свободную от нуклеазы.

Примечание: Если вам необходимо остановиться на этом этапе, образцы можно хранить при температуре –80°C.