Неспецифическая амплификация ДНК-полимеразы Taq является распространенной проблемой в экспериментах ПЦР, которая напрямую влияет на интерпретацию результатов обнаружения и может привести к снижению чувствительности амплификации и даже снижению выхода целевого фрагмента. Использование модификаторов фермента для герметизации активного центра ДНК-полимеразы Taq при комнатной температуре, тем самым ингибируя ДНК-полимеразную активность фермента Taq при комнатной температуре, в настоящее время является наиболее эффективным методом подавления неспецифической амплификации. Двойные герметизирующие антитела, разработанные Yisheng, не только герметизируют полимеразную активность ДНК-полимеразы Taq, но и одновременно герметизируют экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq. Этот двойной подход эффективно предотвращает неспецифическую амплификацию, вызванную неправильным спариванием или димерами праймеров, а также предотвращает генерацию неспецифических сигналов из-за деградации материала, тем самым вдвойне повышая специфичность реагента. Это позволяет реагентам для обнаружения легко справляться с транспортировкой или использованием при комнатной температуре.

1.Сверхвысокая специфичность амплификации — антитело с двойной изоляцией может одновременно изолировать как полимеразную, так и экзонуклеазную активность, эффективно избегая неспецифической амплификации и повышая специфичность.

2.Исключительная чувствительность обнаружения — формула горячего старта обеспечивает эффективное обнаружение малораспространенных генов, предлагая более высокую чувствительность.

3.Исключительная стабильность продукта — сохраняет свои свойства при хранении при температуре 37°C в течение 5 дней или при температуре 4°C в течение 10 дней.

4.Стабильность базовой линии и хорошая линейность — решение проблемы дрейфа базовой линии, что приводит к отличной линейности.

5.Быстрое высвобождение ферментной активности — более 95% ферментной активности можно высвободить при нагревании до 95°C в течение 20 секунд.

6.Широкая применимость ферментов — подходит как для диких, так и для мутантных ферментов Taq, при этом каждый мг антитела способен запечатать 4-10 KU фермента Taq.

1 Блокирование экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq

Синтетические праймерные зонды были соответственно включены в реакционные смеси ДНК-полимеразы Taq, которые были либо не запечатаны, либо запечатаны антителами с двойным замыканием, и реакции проводились при 40°C. Были обнаружены сигналы флуоресценции обоих, и было обнаружено, что антитела с двойным замыканием могут эффективно запечатать экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Taq.

Рисунок 2. Определение эффективности герметизации двойной герметизированной антитело-эндонуклеазной активности.

02 Проверка чувствительности обнаружения

Используя соответственно двойное запечатанное антитело Йесена и антитело компании T Company для запечатывания фермента Taq с последующим обнаружением положительных образцов с помощью технологии ARMS-ПЦР, было обнаружено, что фермент Taq, запечатанный двойным запечатанным антителом Йесена, был точен в амплификации ARMS-ПЦР с более высокой чувствительностью.

Красный: антитело YEASEN+Taq; Синий: антитело поставщика А+Taq.

Рисунок 3. Кривая амплификации ARMS-ПЦР.

03 Проверка стабильности (4°C в течение 10 дней, 37°C в течение 5 дней).

Используя традиционные закрытые антитела и двойные закрытые антитела для соответственного блокирования ДНК-полимеразы Taq, полимераза затем формулируется в полный премикс-раствор, содержащий праймеры и зонды. Этот раствор оставляют при 4°C на 10 дней или при 37°C на 1, 3 и 5 дней, а затем используют для амплификации 10 000 копий плазмиды ASF. Было отмечено, что не было никаких существенных изменений в кривых амплификации и значениях Ct.

Рисунок 4. Кривые амплификации 10 000 копий плазмиды ASF после блокировки Taq-полимеразы традиционным блокирующим антителом (A) и двойным блокирующим антителом (B), амплификация с помощью системы qPCR.

04 Базовое обнаружение

В определенных условиях, когда используются определенные праймеры в сочетании с определенными буферами и инструментами, может возникнуть явление, известное как дрейф базовой линии. Однако использование двойных закрытых антител может эффективно решать проблему дрейфа базовой линии, тем самым способствуя более стабильной базовой линии.

Рисунок 5. Кривые амплификации гена N (A) и гена ACT (B) вируса SARS-CoV-2 в анализе методом ПЦР.

05 Проверка линейности

Реакционная смесь, запечатанная двойными закрытыми антителами, использовалась для амплификации 100 000, 10 000, 1000 и 100 копий двойной плазмиды ASFV/ACT для получения стандартной кривой. Как видно из рисунка 7, обе демонстрируют хорошую линейность.

Рисунок 6. Графики стандартной кривой для гена вируса АЧС и гена ACT, полученные с использованием двухблочной реакционной смеси.

06 Анализ высвобождения ферментативной активности

Используя антитела с двойным закрытием (Cat#31303) от Yeasen для запечатывания фермента Taq и подвергая его термическому шоку при 95°C в течение 20 секунд, была обнаружена ферментативная активность. Можно заметить, что после 20-секундного термического шока при 95°C 31303 может высвобождать более 95% ферментативной активности, что сопоставимо с антителами от Company T.

Таблица 1. Тепловой шок при 95°C в течение 20 секунд фермента.

07 Мультиплексное обнаружение Taq-полимеразы

Двойные закрытые антитела Йесена (Cat#31303) использовались для герметизации трех типов полимераз Taq (дикого типа + два мутантных типа) с коэффициентом герметизации 1 мкг на 5 ед., и измерялись значения флуоресценции и эффективность герметизации. Было обнаружено, что для различных типов полимераз Taq двойные закрытые антитела Йесена (Cat#31303) демонстрировали хорошие эффекты герметизации.

Таблица 2. Эффективность блокировки различных типов Taq-полимеразы.