Описание
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) — это быстрый и высокочувствительный набор для обнаружения на основе реагента WST-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолиевая соль мононатриевой соли). WST-8 — это усовершенствованный реагент МТТ, который может быть восстановлен до высокорастворимого в воде оранжево-желтого формазана дегидрогеназами в митохондриях. Количество образующегося формазана пропорционален числу живых клеток. Значение OD формазана при 450 нм, определяемое микропланшетным ридером, может косвенно указывать на число жизнеспособных клеток. Этот набор широко используется для скрининга лекарств, анализа пролиферации клеток и цитотоксичности, тестирования чувствительности опухолей к лекарствам и обнаружения активности биологических факторов.
Преимущества метода CCK-8
1. Сравнение метода CCK-8 с другими методами обнаружения пролиферации/токсичности клеток.
| Метод обнаружения | Метод МТТ | Метод XTT | Метод WST - 1 | Метод CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Растворимость в воде продукта формазана | Низкий (необходимо добавить органический растворитель для растворения, а затем провести испытание) | Высокий | Высокий | Высокий |
| Характеристики продукта | Пудра | 2 бутылки раствора | Решение | 1 флакон раствора |
| Способ применения | Смешайте с раствором и используйте. | Раствор готовили непосредственно перед применением. | Из коробки | Из коробки |
| Чувствительность обнаружения | Высокий | Очень высокий | Очень высокий | Высокий |
| Обнаружение время | Длинный | Короткий | Короткий | Самый короткий |
| Длина волны обнаружения | 560-600 нм | 420-480 нм | 420-480 нм | 430-490 нм |
| цитотоксичность | Высокая токсичность, полное исчезновение морфологии клеток. | Низкая токсичность, морфология клеток неизменна | Низкий токсичность, морфология клеток неизменена | Низкая токсичность, морфология клеток неизменна |
| Стабильность реагента | Общий | Низкий | Общий | Высокий |
| Массовое тестирование образцов | Достижимый | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
2. Феноловый красный и сыворотка не мешают обнаружению CCK-8.
3. Поскольку цитотоксичность реагента CCK-8 очень низкая, оптимальное время измерения можно определить путем многократного считывания с помощью микропланшетного ридера в разное время после добавления реагента CCK-8.
Доставка и хранение
Продукт можно хранить при температуре от -25 до -15ºC в сухом и темном месте в течение двух лет.
Меры предосторожности
1. В первом эксперименте рекомендуется определить оптимальное количество высеваемых клеток и оптимальное время инкубации реагента CCK-8.
2. Если возможно, используйте многоканальную пипетку, чтобы уменьшить различия между повторными лунками. Избегайте образования пузырьков в эксперименте, поскольку они будут мешать считыванию OD. При добавлении реагента CCK-8 рекомендуется добавлять его близко к стенке планшета для культивирования, а не вставлять в культуральную среду.
3. Лейкоцитам может потребоваться более длительное время инкубации.
4. При использовании стандартного 96-луночного планшета количество высеянных клеток составляет не менее 1000 клеток/лунку (100 мкл). Чувствительность обнаружения лейкоцитов относительно низкая, поэтому рекомендуется высевать не менее 2500 клеток/лунку (100 мкл). При использовании 24-луночного или 6-луночного планшета рассчитайте соответствующее количество клеток для каждой лунки и добавьте соответствующий объем реагента CCK-8 (объем добавленного реагента CCK-8 составляет 10% от объема питательной среды в каждой лунке планшета).
5.Если фильтр 450 нм недоступен, можно использовать фильтр с поглощением в диапазоне 430–490 нм, но фильтр 450 нм обеспечивает наивысшую чувствительность обнаружения.
6. Феноловый красный не влияет на измерение, поскольку поглощение фенолового красного в среде можно исключить, вычитая поглощение пустой группы.
7. В целях вашей безопасности и здоровья при проведении эксперимента надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки.
Инструкции
I. Построить стандартную кривую
1. Приготовьте клеточную суспензию, определите плотность клеток, затем высейте клетки.
2. Последовательно разбавьте клетки культуральной средой в определенном соотношении (например, в соотношении 1:2) для формирования градиента концентрации клеток, обычно 3–5 градиентов концентрации клеток, 3–6 повторных лунок для каждой концентрации.
3. После посева культивируйте клетки в течение 2-4 часов, чтобы они адгезировались. Затем добавьте реагент CCK-8, инкубируйте в течение определенного периода времени и измерьте значение OD. Постройте стандартную кривую с числом клеток в качестве оси X и значением OD в качестве оси Y. Согласно этой стандартной кривой, можно определить число клеток в неизвестном образце (предпосылкой использования этой стандартной кривой является то, что экспериментальные условия должны быть последовательными).
II. Анализ жизнеспособности клеток
1. Поместите клетки (100 мкл/лунку) в 96-луночный планшет. Поместите планшет в инкубатор (37°C, 5% CO2) в течение определенного периода времени для предварительной инкубации.
2. Добавьте 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку (будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков в лунки, так как они будут мешать измерению оптической плотности) и осторожно перемешайте.
3. Поместите планшет в инкубатор и инкубируйте в течение 1–4 часов.
4. Измерьте поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного ридера.
5. Если значение OD не измеряется немедленно, добавьте 10 мкл 0,1 М раствора HCl или 1% w/v раствора SDS в каждую лунку, закройте планшет и храните его в защищенном от света месте при комнатной температуре. Значение поглощения не изменится в течение 24 часов.
III. Анализ пролиферации клеток и цитотоксичности
1. Поместите клетки (100 мкл/лунку) в 96-луночный планшет. Поместите планшет в инкубатор (37°C, 5% CO2) в течение 24 часов для предварительной инкубации.
2. Добавьте в пластину 10 мкл различных концентраций испытуемого вещества.
3. Поместите планшет в инкубатор и инкубируйте в течение определенного периода времени (например, 6, 12, 24 или 48 часов).
4. Добавьте 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку (будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков в лунки, так как они будут мешать измерению оптической плотности) и осторожно перемешайте.
5. Поместите планшет в инкубатор и инкубируйте в течение 1–4 часов.
6. Измерьте поглощение при 450 нм с помощью микропланшетного ридера.
7. Если значение OD не измеряется немедленно, добавьте 10 мкл 0,1 М раствора HCl или 1% w/v раствора SDS в каждую лунку, закройте планшет и храните его в защищенном от света месте при комнатной температуре. Значение поглощения не изменится в течение 24 часов.
Примечание: Если вещество является окисляющим или восстанавливающим, замените старую питательную среду свежей средой (удалите старую среду, дважды промойте клетки свежей средой, а затем добавьте свежую среду) перед добавлением реагента CCK-8, чтобы устранить влияние вещества.Если само вещество имеет только а небольшой влияние на значение поглощения, нет необходимости заменять питательную среду, а влияние вещества можно устранить, вычитая значение поглощения пустой группы с веществом.
Формула расчета
Коэффициент выживаемости клеток =[(AC) /(BC)] x100%
Скорость ингибирования = [(BA) / (BC)] x100%
A: Поглощение экспериментальной группы (поглощение культуральной среды, содержащей клетки, реагент CCK-8 и испытуемое вещество)
B: Поглощение контрольной группы (поглощение культуральной среды, содержащей клетки, реагент CCK-8)
C: Поглощение пустой группы (поглощение питательной среды, содержащей реагент CCK-8)
Цитаты
[1] Сунь Л., Ли П., Цзюй Х и др. В Структурная характеристика генома РНК SARS-CoV-2 vivo выявляет белки хозяина, уязвимые для повторно используемых препаратов. Cell. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF:41.584)
[2] Вэй С., Чжао Ц., Чжэн К. и др. Глутамилирование TAB1, связанное с GFAT1, поддерживает активацию p38 MAPK и способствует выживанию клеток рака легких при глюкозном голодании. Cell Discov. 2022;8(1):77. Опубликовано 9 августа 2022 г. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(ИФ:38.079)
[3] Чэнь X, Чжан Д, Су Н и др. Визуализация динамики РНК в живых клетках с помощью ярких и стабильных флуоресцентных РНК. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH и др. Гетерогенность ферроптоза при тройном негативном раке молочной железы раскрывает инновационную стратегию комбинированной иммунотерапии [опубликовано онлайн до выхода в печать, 11 октября 2022 г.]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX и др. GM-CSF опосредует иммунное уклонение посредством повышения экспрессии PD-L1 в экстранодальных естественных киллерах/Т-клеточной лимфоме. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Опубликовано 29 мая 2021 г. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(ИФ:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y и др. Белок оболочки SARS-CoV-2 вызывает патологические повреждения, подобные острому респираторному дистресс-синдрому (ОРДС), и представляет собой противовирусную мишень. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y и др. FBXO34 способствует латентной активации ВИЧ-1 путем посттранскрипционной модуляции. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(IF:19.568)
[8] Чжоу З, Чжан Х, Лэй Х и др.Обнаружение цитоплазматического хроматина cGAS активирует врожденный иммунный ответ при инфекции SARS-CoV-2. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Опубликовано 3 ноября 2021 г. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(ИФ:18.187)
[9] Ли М., Хао Б., Чжан М. и др. Мелатонин усиливает противоопухолевый иммунитет NK, индуцированный радиочастотой, вызывая перепрограммирование метаболизма рака и ингибирование развития множественных легочных опухолей. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Опубликовано 1 сентября 2021 г. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(ИФ:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X и др. Белки WWC опосредуют активацию LATS1/2 киназами Hippo и подразумевают стратегию подавления опухоли. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X и др. Монометилирование аргинина PRMT7 контролирует противовирусный врожденный иммунитет, опосредованный MAVS. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Супрамолекулярные фотодинамические агенты для одновременного окисления NADH и генерации супероксидного радикала. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Опубликовано 19 октября 2022 г. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF:17.694)
[13] Чжун Дж., Го И., Лу С. и др. Рациональная конструкция трассера с повышенной чувствительностью для обнаружения эффективных ингибиторов APC-Asef. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Опубликовано 24 августа 2022 г. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF:17.694)
[14] Лю Ф., Ван Х., Дуань Дж. и др. Временная последовательная деградация AURKA, опосредованная коктейлем PROTAC, отменяет стволовые клетки острого миелоидного лейкоза. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(IF:16.806)
[15] Цзи Ч., Цю М., Руан Х. и др. Анализ транскриптома выявил симбиотическую нишу 3D-каркасов для ускорения заживления костных дефектов. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(IF:16.806)
[16] Фэн Л., Доу С., Ся И. и др. Терапия нанозимами, покрытыми мембраной нейтрофилподобных клеток, при ишемическом повреждении мозга и долгосрочном неврологическом функциональном восстановлении. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF:15.881)
[17] Ван З, Гун Х, Ли Дж и др. Полифторуглеродные нанотехнологии, доставляющие кислород, улучшают оксигенацию опухолей и усиливают фотодинамически-опосредованный противоопухолевый иммунитет. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF:15.881)
[18] Цзян З., Хэ Л., Юй Х. и др. Антиангиогенез в сочетании с ингибированием пути гипоксии облегчает низкодозную фотодинамическую терапию, вызванную рентгеновским излучением [опубликовано онлайн до выхода в печать, 25 июня 2021 г.]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X и др. Наносистема доставки кислорода, созданная на основе микровезикул, усиливает модуляцию стромы опухоли и противоопухолевый иммунитет, опосредованную радиотерапией. Биоматериалы. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(ИФ:15.304)
[20] Дэн Дж., Сюй В., Лей С. и др. Привлечение и созревание активированных естественных клеток-киллеров с помощью наногелей для целенаправленной иммунотерапии рака поджелудочной железы. Small. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(ИФ:15.153)
Оплата и безопасность
Ваша платежная информация обрабатывается надежно. Мы не храним данные кредитной карты и не имеем доступа к информации вашей кредитной карты.
Расследование
Вам также может понравиться
Часто задаваемые вопросы
Продукт предназначен только для исследовательских целей и не предназначен для терапевтического или диагностического использования на людях или животных. Продукты и содержимое защищены патентами, товарными знаками и авторскими правами, принадлежащими Yeasen Biotechnology. Символы товарных знаков указывают на страну происхождения, а не обязательно на регистрацию во всех регионах.
Для некоторых приложений могут потребоваться дополнительные права интеллектуальной собственности третьих лиц.
Йесен привержен этической науке, полагая, что наши исследования должны затрагивать важнейшие вопросы, обеспечивая при этом безопасность и соблюдение этических стандартов.