Полибрен (гексадиметрин бромид), также известный как полибрен, является катионным полимером, обычно используемым в экспериментах по трансфекции ДНК с клетками млекопитающих для повышения эффективности трансфекции липосом. Он широко используется в трансфекции генов, опосредованной ретровирусом, и трансфекции генов, опосредованной лентивирусом. Механизм действия может включать нейтрализацию сиаловой кислоты на поверхности клетки, облегчая адсорбцию путем преодоления электростатического отталкивания с вирусными частицами. Полибрен также признан антикоагулянтом (антагонистом гепарина) и часто используется в производстве неспецифически агрегированных эритроцитов. Кроме того, при секвенировании белков было показано, что низкие дозы полибрена значительно улучшают деградацию пептидов в автоматическом анализе секвенирования. Добавление полибрена к мембранам PVDF также может повысить сродство мембраны.

Спецификация

Продукт поставляется в форме раствора, а порошок восстанавливается в 0,9% NaCl для получения раствора 10 мг/мл, который затем стерилизуется с использованием фильтра 0,22 мкм. Обычно его разбавляют в соотношении 1:1000-1:2000 для использования, с определенными соотношениями разбавления в зависимости от типа клеток, как указано в соответствующей литературе.

Доставка и хранение

Транспортировка и хранение рекомендуются при температуре -20 ºC, срок годности 2 года. Рекомендуется аликвотировать и хранить, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

Меры предосторожности:

1. В целях безопасности и охраны здоровья надевайте лабораторную одежду и одноразовые перчатки.

2. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.

Оперативные шаги

(для справки, конкретные концентрации могут отличаться, см. соответствующую литературу):

Примечание: Полибрен может проявлять значительную токсичность по отношению к определенным клеткам (например, к терминально дифференцированным нейронам, клеткам ДК), поэтому перед первым использованием рекомендуется провести тест на токсичность.

Эксперимент 1: Ретровирусная инфекция

1. Подготовка рекомбинантного ретровирусного запаса: Культура клеток, содержащая монослой клеток упаковки трансфекционного ретровируса в чашке диаметром 100 мм с 5 мл питательной среды (5% сыворотки). Через 24 часа удалите питательную среду и профильтруйте ее через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм.

2. Культивирование клеток для инфицирования: в чашку диаметром 100 мм добавьте 10 мл полной питательной среды с плотностью клеток 5×10⁵ за блюдо.

3. Инфекция вирусом: После 24 часов культивирования клеток удалите всю культуральную среду. Инфицируйте клетки 2 мл супернатанта вируса, содержащего Полибрен (конечная концентрация: 5-10 мкг/мл) при 37°C в течение 3-6 часов.

4. Соберите вирусные частицы: Добавьте 8 мл полной ростовой среды. Через 2-3 дня культивирования соберите культуральную среду, чтобы получить вирусные частицы.

Эксперимент 2: Трансфекция

1. Культивируйте клетки в полной питательной среде с плотностью клеток приблизительно 50%.

2. Через 18-24 часа культивирования клеток приготовьте смесь ДНК-среды роста-полибрена. Добавьте полную среду роста (2 мл для чашки 60 мм, 3 мл для чашки 100 мм) и подогрейте до 37°C. Аккуратно смешайте 10 нг~10 мкг плазмиды. Добавьте Полибрен до конечной концентрации 5-10 мкг/мл. Аккуратно перемешайте. Каждый компонент следует добавлять в указанном порядке.

3. Удалите культуральную среду и добавьте раствор среды роста ДНК-полибрена к клеткам при температуре 37°C на 6-20 часов. Аккуратно перемешивайте каждые 1,5 часа в течение первых 6 часов культивирования клеток.

4. Удалите среду роста ДНК-раствор Полибрена. Покройте клетки шоковым раствором ДМСО (15% ДМСО в 1× HBSS).Аккуратно встряхивайте чашку для культивирования в течение 10 секунд каждый раз, когда добавляете раствор, чтобы обеспечить равномерное распределение. Инкубируйте клетки при температуре 37°C в течение 4 минут.

5. Немедленно удалите шоковый раствор ДМСО и осторожно промойте клетки дважды полной средой роста. Для чашки диаметром 60 мм промойте каждый раз 5 мл культуральной среды, а для чашки диаметром 100 мм промойте каждый раз 10 мл культуральной среды.

6. Добавьте к клеткам полную питательную среду.

7. Экспрессия белка: через 24–72 часа культивирования соберите клетки для анализа экспрессии белка по мере необходимости.

Отбор клеток: через 24–72 часа культивирования, в зависимости от состояния клеток, перейдите на свежую селекционную среду и продолжите отбор клеток.