Реагент для трансфекции линеаризованного полиэтиленимина PEI 25000 представляет собой высокозаряженный катионный полимер, который легко связывает отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот, образует комплекс и позволяет комплексу проникать в клетку. Реагент для трансфекции представляет собой транзиторный реагент для трансфекции с низкой цитотоксичностью, высокой эффективностью трансфекции и высокой эффективностью экспрессии генов в таких клетках, как HEK293 и CHO. Было подтверждено, что линейный реагент для трансфекции PEI широко применим к различным линиям клеток, включая клетки HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 и Hela и т. д. Реагент совместим со средами, содержащими сыворотку, и может эффективно вводить нуклеиновые кислоты в клетки.

Спецификация

Доставка и хранение

Продукт поставляется при комнатной температуре, а порошок может храниться при температуре 2-8 ºC в течение двух лет. Основной раствор хранится при температуре 2-8 ºC в течение 3 месяцев.

Предостережения


1) После того, как приготовленный раствор ПЭИ извлечен из холодильника при температуре -20 ºC и разморожен, его можно хранить в холодильнике при температуре 4 ºC и нельзя повторно замораживать.

2) Для большинства клеток 3,0 мкл трансфекционного реагента PEI на 1 мкг ДНК могут обеспечить высокую эффективность трансфекции. Вы также можете попробовать использовать 1,5~4 мкл объема линейного трансфекционного реагента PEI на 1 мкг ДНК для оптимизации.

3) В целях вашей безопасности и здоровья во время работы надевайте лабораторный халат, одноразовые перчатки и вытяжной шкаф.

4) Данный продукт предназначен только для научных исследований, а не для использования человеком.

Приготовление основного раствора (1 мг/мл)


1. Материалы

PEI 25000, вода/вода для инъекций (WFI) Milli-Q® или аналогичная вода биологического качества, 12 моль/л соляной кислоты (HCl), 10 моль/л гидроксида натрия (NaOH), одноразовый вакуумный стерильный фильтр PES 0,1–0,2 мкм, стерильная бутылка для хранения из полиэтилена высокой плотности или полипропилена.

2. Приготовьте исходный раствор (1 мг/мл)

1) В стеклянный стакан объемом 1 л добавьте 1 г порошка PEI 25000 в 900 мл сверхчистой воды Milli-Q® или другой эквивалентной биологической воды и равномерно перемешайте на магнитной мешалке до образования небольшого вихря.

2) Добавьте по каплям соляную кислоту (12 моль/л) при перемешивании, чтобы отрегулировать pH до pH<2,0.

3) Закройте верхнюю часть стакана и перемешивайте в течение 3 часов до полного растворения; поддерживайте pH < 2,0 на протяжении всего процесса.

【Примечание】: Возможно наличие небольших волокнистых частиц, которые не растворяются, что является нормальным явлением.

4) Добавляйте по каплям NaOH (10 моль/л) при перемешивании, чтобы отрегулировать pH, пока он не достигнет 6,9 ~ 7,1.

5) Перелейте раствор в мерный цилиндр и добавьте воды до объема 1 л.

6) Отфильтруйте и стерилизуйте с помощью одноразового вакуумного фильтра PES 0,1–0,2 мкм для получения исходного раствора с концентрацией 1 мг/мл.

7) При необходимости отберите аликвотную пробу и храните при температуре -20 °C, сохраняя стабильность в течение 1 года.

【Примечание】: После размораживания раствор для хранения можно хранить при температуре 4 °C, и он стабилен в течение 2 недель, но его нельзя повторно замораживать.

Процедура трансфекции (в качестве примера взят 6-луночный планшет)


1. Инокуляция клеток: для повышения эффективности трансфекции рекомендуется инокулировать клетки за день до трансфекции, а плотность клеток во время трансфекции должна составлять предпочтительно 70–80%.

2. Подготовьте комплекс ДНК-ПЭИ: Подготовьте комплекс ДНК-ПЭИ-нуклеиновая кислота-реагент трансфекции в соответствии со следующей системой:

1) Для каждой лунки с клетками разбавьте 2 мкг целевой ДНК 100 мкл бессывороточной среды и тщательно перемешайте для получения разбавленной ДНК.

[Примечание]: Для разбавителя без сыворотки рекомендуется использовать Opti-MEM или ddH2O.

2) Немедленно добавьте 5 мкл реагента для трансфекции PEI 25000 к 100 мкл разбавителя ДНК, встряхивайте в течение 10 секунд и тщательно перемешайте.

3) Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10–25 мин для образования комплекса реагента трансфекции катионной нуклеиновой кислоты ДНК-ПЭИ.

3. Трансфицированные клетки:

1) Во время образования комплекса удалите среду роста клеток и добавьте в каждую лунку по 2 мл свежей предварительно нагретой полной среды.

2) Добавьте 100 мкл комплекса ДНК-нуклеиновая кислота ПЭИ-ПЭИ непосредственно к клеткам, встряхните культуральный планшет и осторожно перемешайте.

3) Культивируйте в инкубаторе при температуре 37°C, 5% CO2, и экспрессия трансгена может быть обнаружена уже через 7 часов после трансфекции. Пожалуйста, определите подходящее время тестирования самостоятельно.

4. Постоянное ротационное просеивание (опционально)

Через 24 часа после трансфекции клетки были пересеяны в свежую питательную среду (разбавьте клетки более чем в 10 раз) и инкубированы в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2. На следующий день был добавлен скрининговый препарат, соответствующий гену устойчивости к трансфекции. Лекарственно-устойчивые клоны могут быть проверены примерно через 1-2 недели. В течение этого периода питательную среду, содержащую скрининговые препараты, необходимо часто заменять.

Дозировка трансфекции для различных сосудов для культивирования клеток (только для справки):