Веро Набор для определения остатков ДНК клетки-хозяина используется для количественного анализа остатков ДНК клетки-хозяина Vero в промежуточных образцах, полуфабрикатах и ​​готовых продуктах различных биологических продуктов.

В этом наборе используется флуоресцентный зонд Taqman и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет минимальный предел обнаружения на уровне fg и может специфически и быстро обнаруживать остаточную ДНК клеток Vero. Набор необходимо использовать вместе с набором для подготовки образцов остаточной ДНК (кат. № 18461ES).

Продукт Компоненты

^*ИК: Внутренний контроль

Доставка и хранение

1. Перевозится на сухом льду. и хранится при температуре -20°C для 2 год

2. После получения товара, пожалуйста, немедленно проверьте его и поместите на хранение при соответствующей температуре.

Предостережения

1. Перед использованием этого реагента внимательно прочтите данное руководство. Эксперимент должен быть стандартизирован, включая обработку образцов, подготовку реакционной системы и добавление образцов.

2. Добавление образцов и приготовление растворов лучше всего проводить на льду.

3. Перед использованием убедитесь, что каждый компонент тщательно перемешан и центрифугирован на низкой скорости.

4. Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки во время работы.

5. Данный продукт предназначен ТОЛЬКО для исследовательских целей!

Применимые модели инструментов

Включить, но не ограничиваться:

Био-Рад: Оптический модуль CFX96.

Термо Сайентифик: АБИ 7500; ABI Quant Studio 5; Шаг ABI OnePlus.

Инструкция по использованию

1. Веро Стандартное разбавление ДНК и подготовка стандартной кривой

Веро Контроль ДНК был разбавлен градиентом с использованием буфера для разбавления ДНК, входящего в комплект. и концентрация разбавления составляет 300 пг/мкл, 30 пг/мкл, 3 пг/мкл, 300 фг/мкл, 30 фг/мкл, 3 фг/мкл.

Подробные инструкции смотрите ниже:

1.1 Разморозить Веро Контроль ДНК и буфер для разбавления ДНК на льду. После полного размораживания аккуратно перемешайте на вортексе и центрифугируйте на низкой скорости в течение 10 секунд.

1.2 Выньте шесть чистые пробирки объемом 1,5 мл, маркированные 3 нг/мкл, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Добавьте 90 мкл буфера для разбавления ДНК и 10 мкл Vero ДНК-контроль к 1.Микроцентрифужная пробирка объемом 5 мл с маркировкой 3 нг/мкл и разбавьте до 3 нг/мкл. Смешайте и центрифугируйте в течение 10 секунд. Разбавленный стандарт ДНК можно хранить в течение короткого времени (не более 3 месяцев) при температуре -80°C. Избегайте повторного замораживания-оттаивания.

1.4 Добавьте 90 мкл буфера для разбавления ДНК в другие пробирки, затем следуйте приведенной ниже процедуре для серийных разведений.

[Примечания]:

1. Для каждой концентрации требуется три повторных лунки. Диапазон обнаружения составляет 3 фг/мкл-300пг/мкл и При необходимости этот диапазон может быть расширен.

2. Для сокращения количества повторных замораживаний-оттаиваний и избежания загрязнения рекомендуется хранить контроль ДНК в аликвотах при -80°C впервые.

3. После размораживания буфер для разбавления ДНК может хранить при температуре 2-8°C в течение 7 дней, если не используется в течение длительного времени, хранить при температуре -20°C.

4. Убедитесь, что шаблон полностью перемешан, осторожно встряхивайте смесь в течение 15 секунд - 1 минуты. для каждого разбавления градиента.

2. Подготовка к извлечению и восстановлению (ERC)

Установите концентрацию Веро ДНК в ERC по мере необходимости (образец ERC был приготовлен с использованием 3 пг/мкл ДНК в качестве примера) следующим образом:

2.1 Добавьте 100 мкл тестового образца в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем добавьте 10 мкл 3пг/мкл Vero Стандарт ДНК (③) и тщательно перемешайте, обозначьте как ERC.

2.2 Проведите экстракцию ДНК из образца ERC вместе с тестовыми образцами для приготовления очищенного ЭРК образец.

3. Подготовка положительного контрольного образца (ПКО) (необязательно)

Установите концентрацию Веро ДНК в PCS по мере необходимости (PCS был приготовлен с использованием 3 пг/мкл ДНК в качестве примера) следующим образом:

3.1 Добавьте 100 мкл 3 пг/мкл Vero Стандарт ДНК (③) в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем промаркированную как PCS.

3.2 Выполнить выделение ДНК из ПКС вместе с исследуемыми образцами приготовить очищенный ПКС.

4. Отрицательно Приготовление контрольного раствора (NCS)

Установите отрицательный контроль в эксперименте, конкретные этапы работы следующие:

4.1 Добавьте 100 мкл образец матрицы (или буфера для разбавления ДНК) в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем промаркированную как NCS.

4.2 Проведите экстракцию ДНК из образца NCS вместе с исследуемыми образцами для приготовления очищенного образца NCS.

5. Подготовка без контроля шаблона (NTC)

Установить шаблон «нет» контроль в эксперименте, конкретные этапы работы следующие:

5.1 NTC не требует предварительной обработки образца и может быть настроен на этапе определения остаточного содержания ДНК методом ПЦР.

5.2 Образец NTC в каждой пробирке или лунке составляет 20 мкл Микс (т.е. 16 мкл Смесь Vero qPCR + 4 мкл Смесь праймера и зонда Vero) + 20 мкл Буфер для разбавления ДНК. Рекомендуется настроить три лунки-реплики.

6. Система реакции ПЦР

[Примечания]:

1. Рассчитайте общий объем реакции ПЦР по числу реакций: qPCR Mix = (число реакций + 2) × (16 + 4) мкл (включая потери двух реакционных лунок). В эксперименте рекомендуется проводить более трех повторов для каждого образца.

2. После закрытия пробирки или запечатывания пластины центрифугируйте реакционную пробирку или пластину на низкой скорости в течение 10 секунд. После достаточного встряхивания и перемешивания в течение 5 секунд повторите центрифугирование, чтобы собрать жидкость с крышки или стенки на дно. Избегайте образования пузырьков во время работы.

Рекомендуемую конфигурацию пластины см. в таблице ниже:

В состав макета пластины входят: 1 НТК (нет шаблон контроль), 1 НКС (отрицательный контроль) решение), 6 STD (стандартная кривая 6 стандартные концентрации), 3 ТС (тестовые образцы), 3 ERC (контроль извлечения и восстановления), 1 шт. (положительный контрольный образец).Три повторных лунки для каждого образца.

7. Руководство по настройке инструмента ПЦР (2-шаговый метод)

Следующие инструкции применимы только к прибору Thermo ABI 7500 qPCR. (Версия программного обеспечения 2.0). Если вы используете другой инструмент, обратитесь к соответствующему руководству по инструменту для получения инструкций по настройке.

7.1 Создайте новый эксперимент, выберите шаблон абсолютной количественной оценки или определенный пользователем.

7.2 В интерфейсе «Определение» и на панели «Цели» добавьте цель и назовите ее FAM, выберите источник отчета «FAM» и гаситель «none».

7.3 В панели «Образцы» по очереди добавьте информацию обо всех образцах. Затем выберите лунки, выберите цель и образцы соответственно. Установите задачу Vero Стандарт ДНК в качестве стандарта и присваиваем значения 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (единица измерения концентрации ДНК в каждой лунке — фг/мкл) в столбце Количество и назовите лунки STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, соответственно. Задать задачу NTC как NTC. Задать NCS, TS, ERC и ПКС как Неизвестно, и назвали их в соответствии с вышеуказанным макетом Plate соответственно. Затем нажмите «Далее».

7.4 Настройте программу амплификации: установите объем реакции 40 мкл.

8. Анализ результатов ПЦР

8.1 Система автоматически укажет пороговое значение на панели графика амплификации в анализе. Пороговое значение, заданное системой, иногда слишком близко к базовой линии, что приводит к большой разнице в Ct между повторными лунками. Вы можете вручную отрегулировать пороговое значение до подходящего положения и нажать кнопку Анализ. Затем вы можете сначала проверить, является ли кривая амплификации нормальной на многокомпонентном графике.

8.2 На вкладке Result Analysis просмотрите график стандартной кривой. Проверьте значения для Slope, Y-intercept, R2 и Эффективность. Для нормальной стандартной кривой R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 В «Просмотр таблицы скважин» На панели «Анализ» концентрации каждого образца отображаются в поле «Количество», единица измерения — фг/мкл, единицы измерения можно преобразовать в пг/мкл. или пг/мл в отчете по анализу.

Руководства