Используется набор для обнаружения репликативно-компетентных лентивирусов (RCL) количественно обнаружить реплицирующиеся лентивирусы, которые может произойти в Разнообразие клеточных продуктов, связанных с лентивирусом векторы потенциальных рисков.

Этот набор предназначен для создания специальных грунтовок для Последовательность гена VSV-G белков оболочки лентивируса. И он принимает такман  флуоресцентный зонд и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет предел обнаружения на уровне 1 копий/мкл и может специально и быстро обнаружить риск репликативно-компетентного лентивируса. Набор должен для использования вместе с Набор для подготовки образцов остаточной ДНК (кат. № 18461ES).

Компоненты

* IC: Внутренний контроль.

Хранилище

Данный продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃. для 2 годы.

Оба препарата 41311-A и 41311-B следует хранить в защищенном от света месте.

Применимый инструмент модели

Включить, но не ограничиваться: Bio-Rad: Оптический модуль CFX96; Thermo Scientific: АБИ 7500; ABI Quant Studio 5; Шаг ABI OnePlus.

Инструкции

1. ДНК РКЛ Стандарт разбавление и Стандарт изгиб подготовка

Контроль ДНК RCL был градиентно разбавлен с использованием буфера для разбавления ДНК, входящего в комплект*. , и разбавление концентрация 5×10E7 копий/мкл, 5×10E6 копий/мкл, 5×10E5 копий/мкл, 5×10E4 копий/мкл, 5×10E3 копий/мкл, 5×10E2 копий/мкл, 5×10E1 копий/мкл.

Подробные инструкции смотрите ниже:

1) Разморозьте контроль ДНК RCL и буфер для разбавления ДНК на льду. После полного размораживания, осторожно встряхните, чтобы смешать, и Центрифугируйте на низкой скорости в течение 10 секунд.

2) Возьмите семь чистых пробирок объемом 1,5 мл, промаркированных как Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6.

3) Добавить 90 мкл буфера для разбавления ДНК и 10 мкл RCL DNA Control в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой Std0, а именно   разбавьте до 5×10E7 копий/мкл. Смешать и затем центрифугируйте в течение 10 секунд. Подпакуйте разбавленный стандарт ДНК и его можно хранить в течение короткого срока (не более 3 месяцев) при температуре -25~-15℃** .Пожалуйста, избегайте повторного замораживания-оттаивания.

4) Добавить 90 мкл буфера для разбавления ДНК в другие пробирки*** , затем следуйте приведенной ниже процедуре для серийные разведения**** .

Таблица 1 Стандартное градиентное разбавление

*Три копировать скважины являются необходимый для каждый концентрация. обнаружение диапазон является 5×10E1 копий/мкл~5×10E6 копий/мкл и этот диапазон может быть при необходимости расширяется.

** К уменьшать  число из повторить замораживание-оттаивание и избегать загрязнение, это является рекомендуется к магазин  ДНК контроль в аликвоты в -25~-15℃ для  первый время.

*** Один раз размороженный, ДНК разбавление буфер мог быть хранится в 2-8°С для 7 дней, если нет использовал для а длинный время, пожалуйста магазин в -25~-15℃ .

**** Делать конечно  шаблон является полностью смешанный, осторожно встряхнуть  смесь для 15 сек. к 1 мин. для каждый градиент разбавление.

2. Извлечение Восстановление Контроль (ЕРЦ) подготовка

Установите необходимую концентрацию ДНК RCL в ERC (образец ERC был приготовлен с 5×10E4 копирует ДНК RCL как пример), как следует:

1) Добавить 100 мкл тестового образца в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем добавьте 10 мкл 5×10E3 копий/мкл Стандарт ДНК RCL (Std4) и хорошо перемешать, маркировать как ERC.

2) Проведите экстракцию ДНК из образца ERC вместе с тестовыми образцами для получения очищенного образца ERC.

3. Отрицательный контроль Решение (NCS) подготовка

Установите отрицательный контроль в эксперименте, конкретные этапы работы следующие:

1) Добавить 100 мкл матрицы образца (или буфера для разбавления ДНК) в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем промаркируйте как НКС.

2) Провести экстракцию ДНК NCS образец вместе с тестовыми образцами для приготовления очищенного NCS образец.

4. Нет шаблона Контроль (НТК) подготовка

Установите элемент управления «без шаблона» в эксперименте, конкретные шаги операции следующие:

1) NTC не требует предварительной обработки образца и может быть настроен на этапе обнаружения остаточной ДНК методом ПЦР содержание.

2) Образец NTC в каждой пробирке или лунке составляет 20 мкл смеси (т.е. 15 мкл RCL qPCR Mix + 4 мкл РКЛ Праймер и зонд Микс + 1 мкл ИК) + 10 мкл буфера для разбавления ДНК. Рекомендуется настроить три лунки-реплики.

5. ПЦР реакция система

Таблица2 Реакционная система

* Рассчитать  общий ПЦР реакция объем к  число из реакции: кПЦР Смешивание =( число из реакции+2) × (15+4+1) мкл (включая  потери две реакционные лунки). В эксперименте рекомендуется проводить более трех повторов для каждого образца.

** После укупорка  трубка или герметизация  пластина, центрифуга  реакция трубка или тарелка в низкий скорость для 10 сек. После достаточный тряска и смешивание для 5 секунд, повторить центрифуга к собирать  жидкость от  крышка или стена к  дно. Избегайте пузыри в течение операция.

Рекомендуемую конфигурацию пластины см. в таблице ниже:

Таблица 3 Компьютер-вкл. ссылка доска

Схема планшета включает: 6 Std (стандартная кривая 6 стандартных концентраций), 1 NTC (без шаблонного контроля), 1 NCS (отрицательный контрольный раствор), 3 TS (тестовые образцы), 3 ERC (контроль извлечения).Три повторных лунки для каждый образец.

6. Руководство по установке для а ПЦР Инструмент

Следующие инструкции применимы только к Термо Прибор для количественной ПЦР ABI 7500 (программное обеспечение версия 2.0). Если вы используете другой прибор, обратитесь к соответствующему руководству по прибору для получения инструкций по настройке.

1) Создайте новый эксперимент, выберите шаблон абсолютной количественной оценки или определяется пользователем.

2) Создайте 1 зонд обнаружения, назовите его «RCL-DNA», выберите репортерный флуорофор как «FAM» и погасите флуорофор как "none"; создайте еще 1 зонд обнаружения, назовите "IC" и выберите репортерный флуорофор как "CY5" и гашение флуорофор как «нет». Эталонная флуоресценция - ROX" (эталонная флуоресценция может быть основана на модель инструмента и т.д., выберите ли вам нужно добавить его).

3) В Панель «Образцы», добавьте по очереди всю информацию об образцах. Затем выберите лунки, выберите цель и образцы соответственно. Установите задача стандарта ДНК RCL как стандарта, и назначить значения 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (единица измерения концентрации ДНК в каждой лунке — копий/мкл) в столбце Количество и назовите  скважины Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6 соответственно. Установите задача NTC как NTC. Установите NCS, TS и ERC как Неизвестно, и названо им в соответствии с вышеприведенной компоновкой таблички соответственно. Затем нажмите «Далее».

4) Задайте программу амплификации: установите объем реакции 30 мкл.

Таблица4 Процедура амплификации

7. Анализ кПЦР результаты

1) Система автоматически даст пороговое значение в Панель графика усиления Анализ. Порог задан системой иногда слишком близко к базовому уровню, что приводит к большой разнице в Ct между повторными лунками. Вы можете вручную настроить Порог в соответствующее положение и щелкните Проанализируйте. Затем вы можете сначала проверить является ли кривая амплификации нормальной на многокомпонентном графике.

2) В результате На вкладке «Анализ» просмотрите график стандартной кривой. Проверьте Значения R2, ​​эффективности, наклона и Пересечение с осью Y. Для нормальной стандартной кривой R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Slope≤-3,1.

3) В 'Вид хорошо таблица' панель в Анализ, концентрации каждого образца показаны в количестве, блок копий/мкл, единицы измерения можно преобразовать в отчете по анализу.

4) Параметры настройки анализ результатов должен основываться на конкретной модели и программном обеспечении версия используются и, как правило, могут автоматически интерпретироваться прибором.

5) Рассчитайте скорость восстановления спайка на основе результатов теста образец ТС для измерения и пробы восстановление ERC, скорость восстановления требуются шипы быть в пределах от 50% до 150%. Формула измерителя скорости пикового восстановления:

Восстановление (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Объем элюирования (мкл) / Теоретический значение количества добавленной ДНК (например, копий) х 100%。

6) Коннектикут ценность отрицательный контроль NCS должно быть больше среднего значения самая низкая концентрация Ct  стандарт.

7) Шаблон бесплатного управления NTC должно быть Неопределено или Ct значение ≥38.

Примечания

1. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.
2. Для вашей безопасности работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.

3. Перед использованием внимательно прочтите данное руководство. этот реагент, и эксперимент должен быть стандартизирован, включая обработка образцов, подготовка реакционной системы и образец дополнения.

4. Перед использованием убедитесь, что каждый компонент тщательно перемешан и центрифугирован на низкой скорости.

Руководство