НЕК293 Набор для обнаружения остатков ДНК клетки-хозяина используется для количественного анализа HEK293. ДНК клетки-хозяина остается в промежуточных образцах, полуфабрикатах и ​​готовых продуктах различных биологических продуктов.

В этом наборе используется флуоресцентный зонд Taqman и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет минимальный предел обнаружения на уровне fg и может специфически и быстро обнаруживать остаточный HEK293. ДНК клеток. Совместное использование фермента UDG и dUTP может устранить загрязнение, вызванное продуктами амплификации. Набор необходимо использовать вместе с набором Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES).

Отчет о проверке

Технические характеристики

Компоненты

Хранилище

Данный продукт следует хранить при температуре от -25 до -15℃ в течение 2 лет.

Оба препарата 41331-A и 41331-B следует хранить в защищенном от света месте.

Применимые модели инструментов

Включить, но не ограничиваться:

Bio-Rad: оптический модуль CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Инструкции

1. НЕК293Стандартное разбавление ДНК и подготовка стандартной кривой

HEK293 Контроль ДНК был разбавлен градиентом с использованием буфера для разбавления ДНК, входящего в комплект.^*, и разбавление

Концентрация составляет 300 пг/мкл, 30 пг/мкл, 3 пг/мкл, 300 фг/мкл, 30 фг/мкл.

Подробные инструкции смотрите ниже:

• Разморозьте контроль HEK293DNA и буфер разбавления ДНК на льду. После полного размораживания осторожно перемешайте вортексом и центрифугируйте на низкой скорости в течение 10 секунд.
• Возьмите шесть чистых пробирок объемом 1,5 мл, промаркированных Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5.
• Добавьте 90 мкл буфера для разбавления ДНК и 10 мкл контроля HEK293DNA в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, маркированную Std0, а именно: Разбавьте до 3 нг/мкл. Смешайте и центрифугируйте в течение 10 секунд. Разбавленный стандарт ДНК можно хранить в течение короткого времени (не более 3 месяцев) при температуре -25~-15℃.^**.Пожалуйста, избегайте повторного замораживания-оттаивания.
• Добавьте 90 мкл буфера для разбавления ДНК в другие пробирки.^***, затем следуйте приведенной ниже процедуре для серийных разведений^****.

Таблица 1 Стандартное градиентное разбавление

^*Для каждой концентрации требуются три повторных лунки. Диапазон обнаружения составляет 30 фг/мкл~300пг/мкл и этот диапазон может быть расширен.

^**Чтобы сократить количество повторных замораживаний-оттаиваний и избежать загрязнения, рекомендуется в первый раз хранить контроль ДНК в аликвотах при температуре -25~-15℃.

^***После размораживания буфер для разбавления ДНК можно хранить при температуре 2–8 °C в течение 7 дней. Если буфер не используется в течение длительного времени, его следует хранить при температуре от -25 до -15 °C.

^****Убедитесь, что шаблон полностью перемешан, осторожно встряхивайте смесь в течение 15 секунд – 1 минуты для каждого разбавления градиента.

2. Подготовка к извлечению и восстановлению (ERC)

Установите необходимую концентрацию ДНК HEK293 в ERC (образец ERC был приготовлен с 30 пг ДНК HEK293 в качестве примера) следующим образом:

• Добавьте 100 мкл тестового образца в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем добавьте 10 мкл 3 пг/мкл стандарта ДНК HEK293 (Std3) и тщательно перемешайте, обозначив как ERC.
• Проведите экстракцию ДНК из образца ERC вместе с тестовыми образцами для получения очищенного образца ERC.

3. Приготовление раствора отрицательного контроля (NCS)

Установите отрицательный контроль в эксперименте, конкретные этапы работы следующие:

1) Добавьте 100 мкл матрицы образца (или буфера для разбавления ДНК) в чистую пробирку объемом 1,5 мл, затем промаркируйте как NCS.

2) Проведите экстракцию ДНК из образца NCS вместе с тестовыми образцами для приготовления очищенного образца NCS.

4. Подготовка без контроля шаблона (NTC)

Установите элемент управления «без шаблона» в эксперименте, конкретные шаги операции следующие:

1) NTC не требует предварительной обработки образца и может быть настроен на этапе обнаружения остаточной ДНК методом ПЦР.

2) Образец NTC в каждой пробирке или лунке составляет 20 мкл смеси (т. е. 15 мкл смеси HEK293 qPCR + 5 мкл смеси HEK293 Primer&probe) + 10 мкл буфера для разбавления ДНК. Рекомендуется настроить три повторных лунки.

5. Система реакции ПЦР

Таблица2 Реакционная система

^*Рассчитайте общий объем реакции ПЦР по числу реакций: qPCR Mix = (число реакций + 2) × (15 + 5) мкл (включая потери двух реакционных лунок). В эксперименте рекомендуется проводить более трех повторов для каждого образца.

^**После закрытия пробирки или запечатывания пластины центрифугируйте реакционную пробирку или пластину на низкой скорости в течение 10 секунд. После достаточного встряхивания и перемешивания в течение 5 секунд повторите центрифугирование, чтобы собрать жидкость с крышки или стенки на дно. Избегайте образования пузырьков во время работы.

Рекомендуемую конфигурацию пластины см. в таблице ниже:

Таблица 3 Компьютерная референсная плата

Схема планшета включает: 5 Std (стандартная кривая 5 стандартных концентраций), 1 NTC (контроль без шаблона), 1 NCS (отрицательный контрольный раствор), 3 TS (тестовые образцы), 3 ERC (контроль извлечения).Три повторных лунки для каждого образца.

6. Настраивать руководство по использованию инструмента ПЦР(2-этапный метод) (например, прибор Thermo ABI 7500 qPCR, программное обеспечение версии 2.0)

Следующие инструкции применимы только к прибору Thermo ABI 7500 qPCR (версия ПО 2.0). Если вы используете другой прибор, обратитесь к соответствующему руководству по прибору для получения инструкций по настройке.

1) Создайте новый эксперимент, выберите шаблон абсолютной количественной оценки или определенный пользователем.

2) Создайте 1 зонд обнаружения с именем «HEK293-DNA», выберите репортерный флуорофор как «FAM» и гасящий флуорофор как «None». Референтная флуоресценция — ROX» (референтная флуоресценция может быть основана на модели прибора и т. д., выберите, нужно ли ее добавить).

3) В панели «Образцы» добавьте по очереди всю информацию об образцах. Затем выберите лунки, выберите цель и образцы соответственно. Установите задачу HEK293 Стандарт ДНК в качестве стандарта, и присвойте значения 300000, 30000, 3000, 300, 30 (единица концентрации ДНК в каждой лунке — фг/мкл) в столбце Количество, и назовите лунки Std 1, стандартный 2, стандартный 3, стандартный 4, стандартный 5, соответственно. Задать задачу NTC как NTC. Задать NCS, TS и ERC как Неизвестно, и назвали их в соответствии с вышеуказанным макетом Plate соответственно. Затем нажмите «Далее».

4) Настройте программу амплификации: установите объем реакции 30 мкл.

Таблица4 Процедура амплификации

7. Анализ результатов ПЦР

1) Система автоматически укажет пороговое значение на панели графика амплификации в разделе «Анализ». Пороговое значение, заданное системой, иногда слишком близко к базовой линии, что приводит к большой разнице в Ct между повторными лунками. Вы можете вручную настроить пороговое значение в подходящем положении и нажать «Анализ». Затем вы можете сначала проверить, является ли кривая амплификации нормальной на многокомпонентном графике.

2) На вкладке Result Analysis просмотрите график стандартной кривой. Проверьте значения для R², Эффективность, Наклон и пересечение с осью Y. Для нормальной стандартной кривой R²>0,99, 90%<Эфф%<110%, -3,6<Наклон<-3,1.

3) На панели «Просмотр таблицы лунок» в разделе «Анализ» концентрации каждого образца отображаются в количестве, единица измерения — фг/мкл, единицы измерения можно преобразовать в отчете по анализу.

4) Настройки параметров анализа результатов должны основываться на конкретной модели и версии используемого программного обеспечения и, как правило, могут автоматически интерпретироваться прибором.

5) Рассчитайте скорость восстановления пиков на основе результатов испытаний образца TS, который необходимо измерить, и ERC восстановления пиков образца, скорость восстановления пиков должна быть в пределах от 50% до 150%. Формула измерителя скорости восстановления пиков: Восстановление (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Объем элюирования (мкл) / Теоретическое значение количества добавленной ДНК (например, пг) x 100%。

6) Значение Ct отрицательного контроля NCS должно быть больше среднего значения наименьшей концентрации Ct стандарта.

• Контроль без шаблона NTC должен быть неопределенным или значение Ct ≥3

Примечания

1. Данный продукт предназначен только для исследовательских целей.
2. Для вашей безопасности работайте в лабораторных халатах и ​​одноразовых перчатках.

3. Перед использованием этого реагента внимательно прочтите данное руководство. Эксперимент должен быть стандартизирован, включая обработку образцов, подготовку реакционной системы и добавление образцов.

4. Перед использованием убедитесь, что каждый компонент тщательно перемешан и центрифугирован на низкой скорости.

Руководства