Набор для анализа активных форм кислорода использует проникающий в клетки реагент 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетат (DCFDA) для количественной оценки активных форм кислорода в образцах живых клеток. Липофильный нефлуоресцентный DCFDA легко пересекает клеточную мембрану посредством пассивной диффузии с последующим деацетилированием. Деацилированный продукт представляет собой чувствительный к окислителям 2',7'-дихлорфлуоресцеин (DCHF). DCHF позже окисляется ROS с образованием DCF. DCF обладает высокой флуоресценцией и обнаруживается с помощью флуоресцентной спектроскопии или проточной цитометрии с возбуждением/испусканием при 480 нм/525 нм. Rosup, смесь соединений, является индуктором ROS и может использоваться в качестве положительного контроля.

Компоненты продукта

Доставка и хранение

Этот комплект поставляется с пакетом для льда. Хранить при температуре -20°C без света в течение 1 года. Избегать повторного замораживания и размораживания.

Способ применения

1. Подготовка реагента
Раствор DCFH-DA: Перед открытием быстро центрифугируйте на низкой скорости. Приготовьте рабочий раствор DCFH-DA, разбавив 10 мМ DCFH-DA в бессывороточной среде до конечной концентрации 10 мкМ.
[Примечание]: DCFH-DA также можно разбавить в среде без фенолового красного. Используйте свежеприготовленный раствор DCFH-DA, долгосрочное хранение разбавленного DCFH-DA не рекомендуется. Точная требуемая концентрация DCFH-DA будет зависеть от используемой клеточной линии, но общий начальный диапазон будет составлять 10-50 мкМ. Для некоторых клеток, если флуоресценция отрицательного контроля (без зонда DCFH-DA) очень сильная, разбавьте DCFH-DA до 2-5 мкМ и сократите время инкубации соответствующим образом.
Раствор Rosup: Подготовьте рабочий раствор Rosup 100 мкМ, разбавив исходный раствор Rosup 100 мМ в среде без сыворотки. Обычно инкубация с Rosup при температуре 37 ℃ в течение 30 мин - 4 ч в темноте может значительно увеличить ROS.
[Примечание]: Время инкубации Rosup будет зависеть от чувствительности клеточной линии. Например, 30 мин для Hela и 1,5 ч для MRC5. Если увеличение ROS не наблюдается в течение 30 минут, время индукции или концентрация могут быть соответствующим образом увеличены. Если ROS растет слишком быстро, время индукции или концентрация могут быть соответствующим образом уменьшены.
Препараты: Приготовьте интересующий вас препарат в полной среде с 10% FBS или другим подходящим раствором до желаемой концентрации.
2. Рекомендуемый протокол для адгезивных клеток
а) Подготовка клеток: Вырастите адгезивные клетки в стандартной среде для культивирования клеток за день до эксперимента таким образом, чтобы к моменту эксперимента слияние клеток достигло 70%.
б) Введение препарата: Удалите среду. Покройте каждую лунку предварительно подготовленными разведенными препаратами без сыворотки и инкубируйте в течение желаемого времени при температуре 37°C в темноте.
в) (Необязательно) Положительный контроль: покройте лунку положительного контроля предварительно приготовленным раствором Rosup и инкубируйте в течение желаемого времени при температуре 37°C в темноте.
[Примечание]: Для клеток с коротким временем стимуляции (обычно в течение 2 часов) зонд также можно сначала загрузить, а затем добавить Rosup или интересующий препарат.
d) Загрузка зонда ROS: Удалите всю среду и промойте клетки средой без сыворотки 1-2 раза. Покройте каждую лунку предварительно приготовленным раствором DCFH-DA. Инкубируйте при 37℃ в течение 30 мин в темноте.
д) Удалите среду и промойте клетки 1-2 раза средой без сыворотки для удаления свободного DCFH-DA.
3. Рекомендуемый протокол для суспензионных клеток
а) Подготовка клеток: Вырастите суспензионные клетки до концентрации примерно 1,5 × 105 клеток на лунку в день эксперимента.
б) Медикаментозная индукция: Соберите клетки в коническую пробирку путем центрифугирования и ресуспендируйте их в соответствующем количестве предварительно приготовленных разведенных безсывороточных препаратов и инкубируйте в течение желаемого времени при температуре 37°C в темноте.
в) (Необязательно) Положительный контроль: ресуспендируйте клетки положительного контроля с ранее приготовленным раствором Rosup и инкубируйте в течение желаемого времени при температуре 37°C в темноте.
d) Загрузка зонда ROS: Соберите в новую пробирку и промойте клетки центрифугированием дважды в PBS. Ресуспендируйте клетки с ранее приготовленным раствором DCFH-DA с плотностью клеток 1×106-2×107/мл. Затем инкубируйте при 37℃ в течение 30 мин в темноте. Переворачивайте пробирку каждые 3-5 минут, чтобы обеспечить полный контакт между зондом и клетками.
[Примечание]: Плотность клеток должна быть скорректирована в соответствии с последующим методом обнаружения. Например, для проточной цитометрии количество клеток в одной пробирке не должно быть меньше 104/мл или больше 106/мл.
e) Соберите и промойте клетки путем двукратного центрифугирования с бессывороточной средой для удаления свободного DCFH-DA.
4. Обнаружение флуоресценции и анализ данных
Измерение флуоресцентной микроскопии: выполните микроскопию живых клеток с набором фильтров, подходящим для флуоресцеина (FITC), используя флуоресцентный микроскоп. Визуально оцените яркость клеток и сравните контроль и образцы или используйте методы анализа изображений для сравнения сигналов между цифровыми фотографиями клеток.
Измерение методом проточной цитометрии: адгезивные клетки следует собирать с помощью трипсина для приготовления суспензии отдельных клеток; для суспензионных клеток клетки собираются напрямую. В идеале следует проанализировать 10 000 клеток на одно экспериментальное условие. Клетки не должны быть слишком плотными во время эксперимента (<1 × 106 клеток/мл). Исключите дебрис и изолируйте интересующую популяцию клеток с помощью гейтирования. Используя среднюю интенсивность флуоресценции, определите кратность изменения между контрольными и обработанными образцами с Ex/Em = 480/525 нм.
Измерение флуоресцентного микропланшета: Измерьте планшет немедленно на флуоресцентном планшетном ридере при Ex/Em = 480/525 нм в режиме конечной точки в присутствии среды. Вычтите пустые показания из всех измерений и определите кратность изменения от контроля анализа.

Предостережения

1. Промойте клетки после инкубации с DCFH-DA, чтобы уменьшить фоновый шум.
2. Рекомендуется измерять флуоресценцию как можно скорее после инкубации, чтобы избежать возможных ошибок.
3. Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, надевайте лабораторный халат и одноразовые перчатки во время операции.
4. Только для исследовательских целей!