Пуромицин — аминогликозидный антибиотик, получаемый путем ферментации и метаболизма Streptomyces alboniger, который убивает грамположительные бактерии, различные клетки животных и насекомых, подавляя синтез белка. В некоторых случаях пуромицин эффективен против E. coli. Механизм действия заключается в том, что пуромицин является аналогом 3´-конца молекул аминоил-ТрНК, который может связываться с сайтом А рибосомы и включаться в расширенную пептидную цепь. После связывания пуромицина с сайтом А он не будет участвовать ни в каких последующих реакциях, что приведет к преждевременному завершению синтеза белка и высвобождению незрелых полипептидов, содержащих пуромицин на С-конце.

Ген pac, обнаруженный в штамме Streptomyces alboniger, продуцирующем пуромицин, кодирует N-ацетилтрансферазу пуромицина (PAC), которая обеспечивает устойчивость к пуромицину. Это свойство в настоящее время широко используется для скрининга стабильно трансфицированных клеточных линий млекопитающих, несущих плазмиды гена pac.

Общее применение пуромицина в селекции стабильных клеточных трансфекций связано с характеристиками лентивирусных векторов. Большинство коммерческих лентивирусных векторов в настоящее время несут ген pac. В некоторых особых случаях пуромицин также может использоваться для скрининга трансформации штаммов E. coli, несущих плазмиду гена pac.

Данный продукт подходит для культивирования клеток, обычная рабочая концентрация составляет 1-10 мкг/мл.

Кроме того, компания Yeasen также поставляет пуромицин (кат. № 60209ES) в форме раствора, который находится в другом состоянии, но имеет ту же функцию.

Функции

Чистота≥98%

Приложения

Подходит для культивирования клеток

Скриноспецифичные штаммы млекопитающих, стабильно трансфицированные клетки, несущие плазмиды, несущие ген pac

Экран трансформированные штаммы E. coli, несущие плазмиду гена pac

Технические характеристики

Компоненты

Доставка и хранение

The пуромицин гигидрохлорид продукты следует хранить при температуре -15℃ ~ -25℃ для 2 годы.

Инструкции

1. Рекомендуемая рабочая концентрация

Клетки млекопитающих: 1-10 μг/мл, оптимальную концентрацию необходимо определить по кривой гибели.

Escherichia coli: агаровая среда LB использовалась для скрининга Escherichia coli, стабильно трансформированных геном pac в концентрации 125 μг/мл.

Примечание: Скрининг стабильных штаммов E. coli с использованием пуромицина требует точной регулировки pH.

Рекомендуемые концентрации пуромицин гидрохлорид

2. Метод растворения

Растворите пуромицин в дистиллированной воде, чтобы приготовить исходный раствор 50 мг/мл. После стерилизации фильтрацией через 0,22 μм фильтрующей мембраны, аликвотировать и хранить при температуре от -25 до -15℃. В качестве альтернативы его можно растворить в метаноле, чтобы приготовить раствор для хранения с концентрацией 10 мг/мл.

3. Определение пуромицин кривая гибели (в качестве примера взята трансфекция shRNA или трансдукция лентивируса)

Эффективная концентрация экранирования пуромицин связано с типом клеток, состоянием роста, плотностью клеток, метаболизмом клеток и положением клеточного цикла. Для скрининга стабильно экспрессирующих клеточных линий shRNA критически важно определить минимальную концентрацию пуромицина, которая убивает нетрансфицированные/трансдуцированные клетки. Клиентам, которые проводят эксперименты впервые, рекомендуется установить кривую гибели, подходящую для их собственной экспериментальной системы.

1) День 1: 24-луночный планшет высевается с плотностью 5-8×104 клеток/лунку, и достаточное количество лунок высеяно для последующих экспериментов с градиентом. Клетки инкубировали в течение ночи при 37℃.

2) День 2: A) Подготовьте среду для скрининга: свежую среду, содержащую различные концентрации пуромицина (например, 0-15 μг/мл, не менее 5 градиентов); Б) Заменить свежеприготовленную среду скрининга в ячейках после ночной инкубации; Затем клетки инкубируют при 37℃.

3) День 4: Замените среду для селекции на свежую и наблюдайте за жизнеспособностью клеток.

4) В зависимости от состояния роста клеток меняйте селективную среду на свежую каждые 2–3 дня.

5) Клетки ежедневно контролировались для наблюдения за уровнем жизнеспособных клеток с целью определения минимальной концентрации препарата, эффективной для уничтожения нетрансфицированных или всех нетрансдуцированных клеток в течение 4–6 дней после начала скрининга антибиотиков.

4. Скрининг стабильно трансфицированных клеточных линий млекопитающих

После трансфекции плазмиды, содержащей ген pac, клетки размножали в среде, содержащей пуромицин, для отбора стабильных трансфектантов.

1) Через 48 часов после трансфекции клетки (исходные или разбавленные) культивируют в свежей среде, содержащей соответствующую концентрацию пуромицина.

Примечание: Антибиотики наиболее эффективны, когда клетки активно делятся. Если клетки слишком плотные, эффективность антибиотиков будет значительно снижена. Лучше всего высевать клетки до плотности не более 25%.

2) Удалите и замените питательную среду, содержащую пуромицин каждые 2-3 дня.

3) Клеточно-сформированные очаги оцениваются через 7 дней после скрининга. Поражения могут потребовать дополнительную неделю или больше, в зависимости от клеточной линии хозяина и эффективности скрининга трансфекции.

Примечание: Наблюдайте за состоянием роста клеток каждый день. Скрининг пуромицина требует не менее 48 часов, а период скрининга эффективной концентрации пуромицина обычно составляет 3-10 дней.

4) Перенесите и поместите 5-10 устойчивых клонов в чашку Петри диаметром 35 мм и продолжайте культивировать с селективной средой в течение 7 дней. Эта обогащенная культура должна подготовиться к будущему эксперименту по цитотоксичности..

Документы:

Паспорт безопасности

60210_MSDS_HB220421_EN.pdf

Руководства

60210_Руководство_HB250114_EN.pdf

Цитаты и ссылки:

[1] Furge KA. et al., 2001. Подавление Ras-опосредованной опухолеобразования и метастазирования посредством ингибирования рецепторной тирозинкиназы Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Диас Дж. и др., 2014. Rab5 необходим в метастатических раковых клетках для активации, миграции и инвазии Rac1, усиленной кавеолином-1. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Рёссгер К. и др., 2013. Контроль гипертонии на основе вознаграждения с помощью синтетического интерфейса мозг-дофамин. PNAS, 110:18150-5.

[4] Камер И. и др., 2005. Проапоптотический BID является эффектором ATM в реакции на повреждение ДНК. Клетка. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) вызывает CCR5-зависимое ускоренное выделение синдекана-1 (CD138) и синдекана-4 из клеток HeLa и образует.

[6] Гао Дж., Чжао Н., Кнутсон М. Д. и др. Белок наследственного гемохроматоза, HFE, ингибирует поглощение железа посредством подавления Zip14 в клетках HepG2 [J]. Журнал биологической химии, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Хуан Дж., Диббл К.К., Мацузаки М. и др. Комплекс TSC1-TSC2 необходим для правильной активации mTOR2[J]. Молекулярная и клеточная биология, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G и др. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal K. Подавление микроРНК-1 (miR-1) при раке легких. Подавление опухолеобразующих свойств клеток рака легких и их сенсибилизация к апоптозу, вызванному доксорубицином, с помощью miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Журнал биологической химии, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Паатеро А.О., Хилкка Т., Хаппонен Л.Дж. и др. Интеграция бактериофага Mu в геномы дрожжей и млекопитающих [J]. Исследования нуклеиновых кислот, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Чжан Д. и др. Неканонический путь cGAS-STING-PERK облегчает трансляционную программу, критическую для старения и фиброза органов. Nat Cell Biol. 2022 май;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Epub 2022 мая. PMID: 35501370.

[11] Lu T и др. CD73 в небольших внеклеточных везикулах, полученных из HNSCC, определяет иммуносупрессию, связанную с опухолью, опосредованную макрофагами в микроокружении. J Extracell Vesicles. 2022 май;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Чен С. и др.Идентификация убиквитин-специфической протеазы 32 как онкогена в глиобластоме и лежащие в его основе механизмы. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Хан Л. и др. Белок 1, ассоциированный с глобулином матки (UGRP1), связывает подопланин (PDPN), способствуя новому пути воспаления при инфекции Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q и др. Ось MORTALIN-Ca2+ обуславливает врожденную резистентность к ритуксимабу при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. Cancer Lett. 2022 1 июля; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Epub 2022 18 апреля. PMID: 35447282.