G418 Sulfate, также известный как Geneticin Sulfate, является аминогликозидным антибиотиком и структурно похож на Gentamycin B1. Он препятствует синтезу белка, связывая 80s рибосому и блокируя этапы элонгации. G418 Sulfate токсичен как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, включая бактерии, дрожжи, клетки высших растений и млекопитающих, а также простейших и червей. Ген устойчивости (в основном neo), расположенный в транспозоне Tn601 (903) или Tn5, получен из бактерий, но может быть экспрессирован в эукариотических клетках. Ген устойчивости может быть введен в клетки с помощью методов рекомбинации генов для получения устойчивости G418, которая может быть использована для скрининга и поддержания культуры прокариотических или эукариотических клеток, несущих ген устойчивости.

В клетках млекопитающих neoкодирует экспрессию аминогликозид 3'-фосфотрансферазы (APH (3') II) после интеграции в эукариотический геном. Этот фермент инактивирует антибиотик путем ковалентной модификации амино- или гидроксильной функции G418 и ингибирования взаимодействия антибиотика с рибосомой, наделяя клетку устойчивостью к G418. При скрининге экспериментов со стабильными линиями клеток необходимо установить кривые гибели (кривые доза-реакция) для определения минимальной эффективной концентрации для гибели нерезистентных клеток.

В растительных клетках устойчивость может быть получена путем трансфекции плазмиды устойчивости гена nptII. Ген nptII также кодирует аминогликозидфосфотрансферазу, фермент, который инактивирует несколько антибиотиков, включая G418, канамицин и паломицин.

Функции

Чистота≥98%

Стандартизированное производство с использованием режима заводского массового производства

Широкий спектр применения, который может быть использован в области молекулярной биологии и биохимических экспериментальных исследований культуры тканей.

Платформа сотрудничества охватывает всю

Для обеспечения стабильности качества продукции разница между партиями контролируется в пределах 1%.

Приложения

Скрининг стабильно трансфицированных клеточных линий

Технические характеристики

Компоненты

Доставка и хранение

The G418 Сульфат (Генетицин) продукты следует хранить при температуре -15℃ ~ -25℃ для 3 годы.

Инструкции

1. Приготовление раствора для хранения G418 (50 мг/мл, активная концентрация)

1) Преобразование единиц деятельности

Преобразование производилось по следующей формуле: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Значение активности G418, которое варьируется от партии к партии. См. отчет о качестве партии или этикетку на бутылке.

A1: Желаемая вами концентрация активного G418.

A2: Фактическая концентрация G418.

Например, если значение активности G418 в партии составляет 750 ЕД/мг, а активная концентрация G418 составляет 50 мг/мл, фактическая концентрация порошка, которую необходимо приготовить, составляет 1000/750×50 мг/мл=66,67 мг/мл. Если приготовлено 10 мл раствора для хранения G418 (активная концентрация 50 мг/мл), необходимо взвесить 666,7 мг порошка.

2) Стерилизация и консервация

Взвесьте полученный в результате вышеуказанного преобразования порошок и добавьте 10 мл стерильной деионизированной воды для его полного растворения.

Предварительно смочите игольчатый фильтр 0,22 мкм 5 мл стерильной деионизированной воды, а затем простерилизуйте раствор G418 путем фильтрации.Разделите стерилизованный раствор G418 на части и храните при температуре -20℃.

Примечание: ① Не фильтруйте мутный раствор, так как раствор не растворился полностью, процесс фильтрации приведет к потере лекарственного средства, снижению активности конечного раствора. ② Не рекомендуется использовать питательные среды, фосфатные растворы или органические растворители для приготовления раствора для хранения.

2. Обычно используемая концентрация скрининга

В целом, изначально требуется высокая концентрация G418 для скрининга трансформеров, а для поддержания культуры используют низкую концентрацию. Условия роста, типы клеток и другие факторы окружающей среды могут влиять на эффективную дозировку G418, поэтому рекомендуется определять оптимальную концентрацию скрининга с помощью кривой гибели (кривая доза-реакция).

Обычно диапазон скрининга клеток млекопитающих составляет 200–2000 мкг/мл, растительных клеток: 10–100 мкг/мл, дрожжевых клеток: 500–1000 мкг/мл.

Экспериментальные данные по клеточным линиям

3. Установление кривой смертности

Примечание: Для скрининга клеточных линий со стабильной экспрессией целевых белков необходимо определить минимальную концентрацию антибиотиков, способных убить нетрансфицированные клетки-хозяева. Этого можно достичь, построив кривую гибели (кривую зависимости реакции от дозы). Следует выбрать не менее шести концентраций. G418 наиболее активен при обработке митотических клеток, поэтому клетки необходимо культивировать в течение определенного периода времени перед добавлением G418.

1) День 1: Нетрансформированные клетки помещают на подходящую культуральную чашку с плотностью клеток 20–25 % при температуре 37 ℃ и культивируют в течение ночи в CO2.₂;

Примечание: для клеток, требующих более высокой плотности для определения жизнеспособности, количество инокуляции может быть увеличено.

2) Установите градиент концентрации G418 в соответствующем диапазоне в соответствии с типом клеток. Для клеток млекопитающих можно установить значения 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 мкг/мл.

3) День 2: Удалите старую среду и замените ее свежеприготовленной средой, содержащей соответствующую концентрацию препаратов. Сделайте три параллельных опыта для каждой концентрации.

4) Затем каждые 3–4 дня заменяйте среду свежей, содержащей G418.

5) Подсчет живых клеток выполняется с фиксированным циклом (например, каждые 2 дня) для определения подходящей концентрации. Выберите минимальную концентрацию, которая убивает большинство клеток в течение идеального количества дней (обычно 7-10 дней), в качестве рабочей концентрации для стабильного скрининга трансфекционных клеток.

4. Скрининг стабильно трансфицированных клеток

1) Через 48 ч после трансфекции культуральную среду G418, содержащую соответствующую концентрацию, использовали для субкультивирования (прямое субкультивирование или разбавленное субкультивирование).

Примечание: Для получения хороших результатов скрининга рекомендуется разбавлять клетки не более чем на 25%.

2) Меняйте среду скрининга, содержащую лекарственные препараты, каждые 3–4 дня.

3) Измерьте образование колоний клеток через 7 дней скрининга. Образование колоний может занять еще неделю или больше, в зависимости от типа клетки-хозяина, трансфекции и эффективности скрининга.

4) Отбирали 5–10 устойчивых клонов, переносили их на 35-миллиметровые планшеты для культивирования клеток и культивировали в среде для скрининга, содержащей лекарственные препараты, в течение 7 дней.

5) Замените на обычную среду.

Документы:

Паспорт безопасности

60220_MSDS_HB220421_EN.pdf

Руководства

60220_Руководство_HB250115_EN.pdf

Цифры

Рисунок1.Тест на стабильность и валидация эффективной концентрации геномицина между различными партиями

Экспериментальный штамм: E. coli

G69 и G99 — это две разные партии.

Концентрация геномицина при использовании была определена как 8 мг/л, 12 мг/л и 16 мг/л соответственно, а эффективная минимальная концентрация была определена как 16 мг/л, что идеально подавляло рост различных бактерий. Эффективность двух партий была одинаковой.