Гигромицин B, аминогликозидный антибиотик, синтезируемый Streptomyces hygroscopicus, подавляет синтез белка, препятствуя 70S рибосомальной транслокации и вызывая неправильное считывание шаблона мРНК, тем самым убивая прокариот (таких как бактерии), эукариот (таких как дрожжи, грибы) и высших млекопитающих эукариот.

Гены устойчивости к гигромицину (hyg или hph), полученные из Escherichia coli, кодируют фосфотрансферазу гигромицина B, которая детоксифицирует гигромицин B в небиологически активный фосфорилированный продукт, что делает его отличным селективным маркером для скрининга и культивирования прокариотических или эукариотических клеток, успешно трансфицированных генами устойчивости к гитромицину. Кроме того, из-за различных способов действия гигромицин B часто используется в сочетании с G418 или бластицидином S для отбора линий клеток с двойной устойчивостью. Гигромицин B также может использоваться в качестве противовирусного средства, поскольку он избирательно проникает в клетки с повышенной проницаемостью мембран из-за вирусной инфекции и ингибирует трансляцию. Он также может действовать как репеллент от насекомых при смешивании с кормом для животных.

Кроме того, компания Yeasen также выпускает гигромицин B (кат. № 60224ES) в форме раствора, который находится в другом состоянии, но имеет ту же функцию.

Функции

Стандартизированное производство с использованием режима заводского массового производства

Приложения

Скрининг стабильно трансфицированных клеточных линий

Технические характеристики

Компоненты

Доставка и хранение

The Гигромицин В продукты следует хранить при -15℃ ~ -25℃ для 2 годы.

Инструкции

1. Приготовление основного раствора (50 мг/мл)

Взвесьте 0,5 г гигромицина В и добавьте его к 10 мл 1×PBS, pH 7,4. После полного растворения профильтровать через 0,22 μм фильтр для стерилизации. Аликвотировать на небольшие объемы для одноразового использования (например, 1 мл) и хранить при температуре от -25 до -15℃или 2 к 8℃.

2. Обычно используемая концентрация скрининга

Рабочая концентрация гигромицина В, используемая для скрининга стабильных штаммов переноса, должна варьироваться в зависимости от типа клеток, среды, условий роста и скорости метаболизма клеток, рекомендуемые концентрации составляют 50–1000. μг/мл. Для первой экспериментальной системы рекомендуется использовать кривую гибели (кривую гибели), кривую реакции дозы, чтобы определить оптимальную концентрацию скрининга.

В целом клетки млекопитающих: 50-500 μг/мл; Бактериальные/растительные клетки: 20-200 μг/мл; Грибы: 300-1000 μг/мл.

3. Установление кривой смертности

Примечание: Для скрининга стабильных клеточных линий необходимо определить минимальную концентрацию антибиотиков, способных убить нетрансфицированные клетки-хозяева. Этого можно достичь, построив кривую гибели (кривую зависимости реакции от дозы). Необходимо организовать не менее пяти концентраций.

1) День 1: Нетрансформированные клетки высаживают в соответствующую культуральную чашку с плотностью клеток 20–25 % и культивируют в течение ночи.

Примечание: Количество инокуляционных клеток может быть увеличено для клеток, требующих более высокой плотности для определения жизнеспособности.

2) Установите градиент концентрации в соответствующем диапазоне в соответствии с типом клетки.Клетка млекопитающего может установить 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μг/мл. Разбавьте раствор гигромицина В 1:10 деионизированной водой или буфером PBS до 5 мг/мл. Затем разбавьте раствор до соответствующей рабочей концентрации согласно следующей таблице.

3) День 2: Заменить свежеприготовленной средой, содержащей соответствующую концентрацию препарата. Приготовить три параллельных образца для каждой концентрации.

4) Затем каждые 3–4 дня заменяйте среду свежей, содержащей лекарственные препараты.

5) Проводите подсчет живых клеток через фиксированные интервалы (например, каждые 2 дня), чтобы определить соответствующую концентрацию, которая подавляет рост нетрансфицированных клеток. Выберите самую низкую концентрацию, которая может убить подавляющее большинство клеток в течение идеального количества дней (обычно 7-10 дней) в качестве рабочей концентрации для стабильного выбора трансфектанта.

4. Скрининг стабильно трансфицированных клеточных линий млекопитающих

1) Через 48 ч после трансфекции клетки пересевали в среду для скрининга, содержащую гигромицин В в соответствующей концентрации (прямой или разбавленный).

Примечание: антибиотики лучше всего действуют на активно делящиеся клетки. Если клетки слишком плотные, антибиотик не убьет их. Разделите клетки так, чтобы они были не более чем на 25% слитыми.

2) Меняйте среду скрининга каждые 3–4 дня.

3) Измерьте образование колоний клеток через 7 дней скрининга. Образование колоний может занять еще неделю или больше, в зависимости от типа клетки-хозяина, трансфекции и эффективности скрининга.

4) Отберите 5–10 устойчивых клонов и перенесите их на 35-миллиметровые планшеты для культивирования клеток, а затем культивируйте в среде для скрининга, содержащей лекарственные препараты, в течение 7 дней.

5) Заменить среду для культивирования на свежую без лекарственных препаратов.

Документы:

Паспорт безопасности

60225_MSDS_HB220420_EN.pdf

Руководства

60225_Руководство_HB250115_EN.pdf