Ауреобазидин А, также известный как AbA, Базифунгин, бреомицин А, представляет собой циклический эфирный пептидный антибиотик, выделенный из нитчатого гриба Aureobasidium Pullulans № R106. Он обладает сильной противогрибковой активностью и является ингибитором инозитолфосфорилированной церамидсинтазы AUR1. Он токсичен для дрожжей даже при более низких концентрациях (0,1-0,5 мкг/мл). Виды грибков, восприимчивых к ауреобасидину А, включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans и A. niger. Виды грибков, восприимчивых к нему, включают зубные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nest (Aspergillus nidulans) и Aspergillus niger (A. niger.). Механизм действия заключается в том, что ауреобасидин А ингибирует активность инозитолфосфорамидит (инозитолфосфорилцерамид, IPC) синтазы, от которой зависит рост грибка, и препятствует синтезу сфинголипидов, тем самым еще больше убивая штамм. Больше генов, кодирующих IPC-синтазы, были изучены, как ген AUR 1 из Saccharomyces cerevisiae и ген AURA из A. sinensis, который имеет гомологию. Отключение этих кодирующих генов делает штаммы устойчивыми к ауреобасидину A, например, ген AUR 1-C.

Ауреобазидин А очень подходит в качестве маркера селекции лекарственных средств для скрининга положительных клонов. Устойчивость к ауреобазидину А также является идеальным репортером в исследованиях дрожжей с одним гибридом и двумя гибридами. Этот продукт представляет собой раствор ауреобазидина А, растворенного в метаноле с концентрацией 1 мг/мл.

Функции

Чистота≥97%

Стандартизированное производство с использованием режима заводского массового производства

Приложения

Исследования двугибридных дрожжей

Исследования одногибридных дрожжей

Строгий маркер отбора дрожжевых препаратов

Резистентность к ауреобасидину А является идеальным репортером для исследований гибридизации дрожжей.

Технические характеристики

Компоненты

Доставка и хранение

The Ауреобазидин А（АбА） продукты следует хранить при -15℃ ~ -25℃ для 2 годы.

Инструкции

1. Рабочая концентрация

Пожалуйста, обратитесь к соответствующей литературе для получения информации о конкретной концентрации, а также изучите и оптимизируйте ее в соответствии с вашими собственными экспериментальными условиями (например, целью эксперимента, типом клеток, характеристиками культуры и т. д.)

2. Эксперимент на клетках (эксперимент in vitro)

Ауреобазидин А останавливает рост дрожжевых клеток как за счет интоксикации церамидами, так и за счет лишения необходимых инозитолфосфорилцерамидов.^[1].

Были синтезированы тройные тандемные повторы каждого мотива CArG-box. Все фрагменты ДНК были клонированы в вектор Y1H pAbAi (Clontech, Mountain View, США) с использованием подходящих сайтов рестрикции. Затем каждая собранная конструкция pAbAi была линеаризована с помощью BstbI и трансформирована в штамм Saccharomyces cerevisiae Y1HGold в соответствии с Руководством по системе трансформации дрожжей 2 (Clontech, Mountain View, США). Клоны, несущие желаемый фрагмент ДНК, были проверены на автоактивацию на синтетической среде для выпадения урацила, дополненной ауреобазидином А в концентрации 100–900 нг/мл, как указано (Clontech, Маунтин-Вью, США)^[2].

Открытые рамки считывания (ORF) генов SlBES1 были амплифицированы и лигированы в плазмиду pGBKT7-GAL4BD. Слитые конструкции GAL4BD-SlBES1 были далее трансформированы в дрожжевые клетки Y2H Gold. SD/−Для культивирования дрожжевых трансформантов использовались чашки Петри со средой Trp.The α-галактозидазная активность трансформантов была идентифицирована с помощью X-α-гал и экспрессия AUR1-C были проверены с помощью Ауреобасидина А^[3].

3. Минимальные ингибирующие концентрации Ауреобазидина для различных дрожжей

4. Операционные процедуры (для системы трансформации дрожжей, устойчивой к AbA)

1) Добавьте 0,5 мл ночной культуры дрожжей к 50 мл среды YPD (состав: 1 л жидкой среды содержит 10 г дрожжевого экстракта, 20 г полипептона, 20 г D-глюкозы; для твердой среды добавьте дополнительно 2% агара).

2) Инкубировать при 30℃ в течение примерно 6 часов, пока OD660 не станет 1-2. При использовании диплоидов измерьте OD660, чтобы он был 2-4.

3) Центрифуга при 1000×г в течение 5 минут.

4) Ресуспендируйте осадок в 10 мл раствора А (состав: 100 мМ ацетата лития, 10 мМ Трис-HCl pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), затем центрифугируйте при 1000×г в течение 5 минут.

5) ЭСуспендируйте осадок в растворе А до тех пор, пока OD660 не достигнет 150.

6) Отберите 100 мкл клеточной суспензии в пробирку и инкубируйте при 30°С.℃ в течение 1 часа.

7) Добавьте 5 мкг вектора (кольцевой или линейной ДНК) и 150 мкг ДНК-носителя (нагретой до 100°С).℃ в течение 10 минут, а затем быстро охлаждают).

Примечание: pAUR101 требует линейной ДНК для трансформации. Использование кольцевой ДНК снизит эффективность трансформации или может даже потерпеть неудачу. pAUR112 и pAUR123 требуют полной плазмидной ДНК для трансформации.

8) Добавьте 850 мкл раствора B (состав: растворите 40 г полиэтиленгликоля 4000 в 100 мл раствора A и тщательно перемешайте, готовьте свежий раствор перед использованием) и осторожно перемешайте.

9) Инкубировать при 30℃ в течение 30 минут, затем в 42℃ в течение 15 минут.

10) Оставьте при комнатной температуре на 10 минут.

11) Центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 1 минуты и ресуспендируйте осадок в 5 мл среды YPD.

12) Инкубировать при 30℃ на 6 часов или на ночь.

13) Центрифугируйте при 5000–10 000 об/мин и ресуспендируйте осадок в 1–10 мл 0,9% NaCl.

14) Нанесите 100 мкл клеточной суспензии на чашки Петри с селективной средой YPD (содержащей определенную концентрацию AbA в зависимости от типа штамма).Инкубировать при 30℃ в течение 3–4 дней, пока трансформация не завершится.

15) Выберите положительные трансформанты и/или определите эффективность трансформации (выраженную как количество трансформированных колоний на микрограмм плазмидной ДНК).

Документы:

Паспорт безопасности

60231_MSDS_HB220420_EN.pdf

Руководства

60231_Руководство_HB250116_EN.pdf

Цифры

Рисунок1. Диаграмма роста дрожжей на пластине

Экспериментальный штамм:GS115

Объем использования: 0,05 мкг/мл、0,1 мкг/мл、0,5 мкг/мл、1 мкг/мл

Уход: 3-5 Деньс в 30℃

Верхний ряд — это продукт на основе дрожжей, а нижний ряд — марка Т*.