Vill du kontrollera tumörtillväxt hos nakna möss i realtid? Vill du veta platsen för cellkolonisering hos möss? Vill du veta effekten av läkemedelsbehandling på tumörer in vivo? Dessa kan uppnås genom att installera en tracker på cellen, så att du kan kontrollera platsen och antalet celler när som helst. Denna teknik är in vivo-avbildnings-"detektionsteknik". Så vad är in vivo bildteknik?

1. Vad är in vivo-avbildningsteknik?
2. Egenskaper för luciferasavbildning
3. Appliceringsriktning för luciferasavbildning
4. Experimentell exempeldelning
5. Vanliga frågor
6. Produktinformation
7. Angående läsning

1. Vad är in vivo-avbildningsteknik?

Redan 1999 föreslog Dr. Weissleder vid Harvard University i USA konceptet molekylär avbildning, det vill säga att använda avbildningsmetoder för att bedriva kvalitativ och kvantitativ forskning om biologiska processer in vivo på cellulär och molekylär nivå. In vivo-avbildning är baserad på molekylär avbildning. Genom detta avbildningssystem kan biologiska processer som tumörtillväxt och metastaser, utveckling av infektionssjukdomar och uttryck av specifika gener observeras hos levande djur.

In vivo antar optisk avbildning av levande djur huvudsakligen två tekniker: bioluminescens och fluorescens. Bioluminescens är luciferasgenen för att markera celler eller DNA, medan fluorescensteknologi använder fluorescerande reportergener som grönt fluorescerande protein och rött fluorescerande protein och fluorescens som FITC, Cy5 och Cy7. Element och kvantprickar (QD) för märkning. Däggdjursbioluminescens integrerar i allmänhet eldflugans luciferasgen (som består av 554 nukleotider, cirka 50 KD), det vill säga luciferasgenen, i kromosomalt DNA hos den förväntade observationscellen för att uttrycka luciferas. Odla sedan en cellinje som stabilt kan uttrycka luciferas, och när cellerna delar sig, differentierar och överförs kommer luciferaset också att fortsätta att uttryckas stabilt. Gener, celler och levande djur kan alla märkas med luciferasgenen. Luciferas är ett slags enzym som kan katalysera substrat för att producera bioluminescens. Luciferaser från olika källor har sina egenskaper och kan katalysera substrat för att avge olika färger av ljus. Bland dem har eldflugeluciferas hög känslighet och ett brett linjärt område på 7 ~ 8 storleksordningar. Det har blivit den vanligast använda reportergenen för däggdjursceller. Luciferasreporterplasmiden överfördes till cellerna och dess substrat luciferin tillsattes för att inkubera cellerna. I närvaro av ATP, O₂och magnesiumjoner, kunde luciferas oxidera luciferinsubstratet för att producera en reaktion med synligt ljus. Förverkliga "engångs-'tracker'-installation, och spåra och upptäcka när som helst". Förutom eldflugeluciferas används ibland renillaluciferas. Substraten för de två är olika, substratet för det förra är D-luciferin och substratet för det senare är coelenterazin. De ljusemitterande våglängderna för de två är olika, området för ljusvåglängden som emitteras av den förra är 540-600 nm, och området för ljusvåglängden som emitteras av den senare är 460-540 nm. Ljuset som emitteras av den förra är lättare att passera genom vävnader, medan den senare metaboliseras snabbare i kroppen, och dess specificitet är inte lika bra som den förra. Därför inte de flesta in vivo-experiment som använder eldflugeluciferas som en reportergen.

Bild 1.Lokalisering av luciferasmärkta celler

Den optiska principen för bioluminescens: ljus kommer att spridas och absorberas när det förökar sig i däggdjursvävnader, och fotoner kommer att brytas när de möter cellmembran och cytoplasma, och olika typer av celler och vävnader har olika egenskaper för att absorbera fotoner. Hemoglobin är den främsta orsaken till absorptionen av synligt ljus i kroppen och kan absorbera det mesta av det blågröna bandet av synligt ljus. Men i det röda ljusbandet av synligt ljus större än 600nm är absorptionen av hemoglobin mycket liten. Därför kan en stor mängd ljus passera genom vävnad och hud för att upptäckas i det rödaktiga området. Åtminstone några hundra subkutana celler kan detekteras med hjälp av bioluminiscerande avbildningsteknik för levande djur. Men beroende på djupet på ljuskällan i musen varierar det minsta antalet celler som kan ses. Generellt sett, för varje ökning med 1 cm dämpas ljusstyrkan med 10 gånger, och dämpningen är mer för vävnader och organ rika på blod, och mindre dämpning för vävnader och organ intill ben. I fallet med samma djup har den detekterade ljusintensiteten ett signifikant linjärt samband med antalet celler, och den detekterade ljusintensiteten kan kvantifieras av instrumentet för att reflektera antalet celler.

Figur 2. Den självlysande principen för reaktionen med luciferas och luciferinkaliumsalt

Till skillnad från bioluminescens använder fluorescensteknologi fluorescerande reportergener eller fluorescerande färgämnen (inklusive nya nanomärkningsmaterial som fluorescerande kvantprickar) för märkning. Genom att använda fluorescens från reportergener, fluorescerande proteiner eller färgämnen kan en biologisk ljuskälla in vivo skapas. Bioluminescens är autofluorescens hos djur utan en excitationsljuskälla, medan fluorescens kräver excitation av en extern excitationsljuskälla innan den kan detekteras av bildsystemet. Fluorescerande etiketter används ofta, inklusive djur, celler, mikroorganismer, antikroppar, läkemedel, nanomaterial, etc.

2. Egenskaper för luciferasavbildning

◎ ingen strålning, nästan ofarlig för organismer.

◎ bioluminescens utan excitationsljuskälla.

◎ hög känslighet, hundratals celler kan detekteras.

◎ bra penetreringsförmåga, 3-4 cm vävnadsdjup kan fortfarande detekteras.

◎ högt signal-brusförhållande, stark fluorescenssignal och bra anti-interferens.

3. Appliceringsriktning för luciferasavbildning

3.1 Tumörtillväxt

I tumörbildningsexperimentet i nakna möss observerades tumörtillväxten i realtid utan invasion, och det fanns inget behov av att ta bort tumören för mätning.

3.2 Onkologiska läkemedel

Inverkan av administrering på tumörtillväxt eller metastasering upptäcktes, och fluoresceinsubstratet kunde elimineras inom 3 timmar, utan störning av läkemedelsexperimentet.

3.3 Celllokalisering

Lokaliseringen och distributionen av främmande celler i djur detekterades.

3.4 Reglering av genuttryck

Målgenen eller promotorn för målgenen fusionerades med luciferasgenen för att detektera genuttrycksförändringar under läkemedelsbehandling eller sjukdomsförloppet.

3.5 Stamcellsforskning

Övervakning av transplantation, överlevnad och spridning av stamceller; Spåra distribution och migration av stamceller in vivo.

4. Experimentera exempel delning

Figur 3. in vivo avbildningsdetektion av den terapeutiska effekten av CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T-celler på tumörbildning genom subkutan injektion av HN4-celler i möss^[1].

Figur 4. Efter att HUC-MSCs-celler injicerades i musskelettmuskel, upptäcktes lokaliseringen av celler av in vivo bildbehandling (markerad med röd pil)^[2].

Figur 5. Förmågan hos in vivo avbildning för att upptäcka migrationen av mesenkymala stamceller (MSC) till brännplatser. Mesenkymala stamceller (MSC/FLuc) injicerades intravenöst i mus-back burn-modellen. Fyra dagar efter injektionen uppträdde bioluminescenssignaler på det skadade stället för brännsåret och minskade sedan gradvis (den röda pilen indikerar brännsåret)^[3].

5. Vanliga frågor

F1: Jämfört med traditionell teknik, vilka är fördelarna med bioluminescensbildteknik?

Jämfört med traditionell teknik är denna teknik känsligare än de traditionella metoderna inom forskning om tumörmetastaser, genterapi, epidemiologi, stamcellsspårning, leukemi och annan relaterad forskning. Den kan också snabbt och intuitivt studera patogenes och läkemedelsscreening av relaterade sjukdomar genom en serie transgena djursjukdomsmodeller.

F2: Hur märker man stamceller med luciferasgenen?

De konstitutivt uttryckta generna kan märkas för att göra transgena möss, och stamcellerna märks. De hematopoetiska stamcellerna tas från musens benmärg och transplanteras in i en annan muss benmärg. Denna teknik kan användas för att spåra spridning, differentiering och migration av hematopoetiska stamceller i kroppen. En annan metod är att märka stamceller med lentivirus.

F3: Hur länge är det lämpligt att testa efter fluoresceininjektion, och hur länge kan luminescensen pågå?

I allmänhet når fluorescenssignalen den starkaste stabila perioden efter intraperitoneal injektion i 10-15 minuter och börjar avta efter 20-30 minuter. Efter 3 timmar elimineras fluoresceinet och luminescensen försvinner helt.

F4: Hur injicerar man fluorescein i möss? Vad är skillnaden mellan injektionsmetoder?

Fluorescein kan injiceras i möss genom intraperitoneal injektion eller svansveninjektion. Det kan spridas till hela kroppen av möss på cirka 1 min. I de flesta fall är koncentrationen av fluorescein 150 mg/kg. För 20 g möss kan ca 3 mg fluorescein användas. För intraperitoneal injektion är diffusionen långsam, den initiala luminescensen är långsam och den kontinuerliga luminescenstiden är lång. För svansvensinjektion av fluorescein diffunderar det snabbt och börjar avge ljus snabbt, men varaktigheten av luminescensen är kort.

6.Produktinformation

Yeasen är ett bioteknikföretag som är engagerat i forskning, utveckling, produktion och försäljning av tre viktiga biologiska reagenser: molekyler, proteiner och celler. Produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande.

Tabell 1. Produktinformation

7. Angående läsning

En ny generation av luciferasreportergendetektionssystem——enklare, känsligare, mer exakt