1. Vad är dendritiska celler (DC)?
Dendritiska celler (DC) är de mest effektiva antigenpresenterande cellerna (APC) i människokroppen. DC:er är de enda APC:er som på ett robust sätt kan stimulera naiv T-cellsproliferation. Andra typer av APC (som monocyter, makrofager, B-celler, etc.) kan bara stimulera aktiverade eller minnes-T-celler. Därför är DC-celler initiatorer av adaptiva T-cellsimmunsvar och spelar en extremt viktig roll i tumörimmunitet. DC-celler uttrycker i hög grad MHC-I- och MHC-II-molekyler på sin yta och har specifika ytmarkörer. De tar upp, bearbetar och stimulerar T-celler att aktivera antigener och bestämmer slutligen differentieringsriktningen för T-celler.
2. Källa till DC
DC-celler finns i mycket små mängder i kroppen. Det tar lång tid att direkt isolera DC från kroppen och cellutbytet är mycket lågt, vilket i hög grad begränsar forskningen och tillämpningen av DC. DC kan dock differentieras och induceras från DC-prekursorceller i olika vävnader, såsom prekursorceller i benmärgsvätska, monocyter i perifert blod och navelsträngsblod.
För människor, eftersom humant perifert blod är det bekvämaste att erhålla och har det största antalet monocyter, är den mest använda metoden att inducera DC från humana perifera mononukleära blodceller (PBMC). För möss är den vanligaste metoden att inducera DC från benmärgsceller, nämligen benmärgshärledda dendritiska celler (BMDC).
Figur 1. Schematisk bild av den klassiska BMDC-beredningsmetoden
3. BMDC beredningsmetod
Vanliga metoder för att förbereda mus-BMDC är:
3.1 Klassisk BMDC-odlingsmetod - Inaba-metoden (modifierad)
3.2 Storskalig framställning av BMDC - Sons-metoden
3.3 Storskalig framställning av BMDC - Lutz-metoden
3.1 [Klassisk BMDC-odlingsmetod] - Inaba-metoden (förbättrad)
【Bakgrund】
a. Antalet BMDC erhållna med Inaba-metoden är 5-7 x 106/mus;
b. Den ursprungliga Inaba-metoden använder endast GM-CSF för att inducera produktionen av BMDC. Även om de erhållna BMDC:erna har en stark stimulerande förmåga i den blandade lymfocytreaktionen, är mognaden för DC:er inte lika bra som den för den kombinerade induktionen av GM-CSF+IL-4. Därför använder den efterföljande förbättrade metoden ofta den kombinerade induktionen av GM-CSF+IL-4.
【Odlingssteg】
3.1.1 Skaffa musbenmärgsceller
1) Möss (6-10 veckor gamla) dödades av cervikal dislokation, alla lårben och skenben avlägsnades kirurgiskt och muskelvävnaden runt benen avlägsnades så mycket som möjligt med sax och pincett.
[Notera] Skada inte benen.
2) Flytta benet till den rena bänken och blötlägg det i en steril odlingsskål innehållande 70 % alkohol i 2-5 minuter för att desinficera och sterilisera, tvätta det sedan två gånger med steril PBS.
3) Flytta benet till en annan ny odlingsskål som innehåller PBS, skär de två ändarna av benet med en sax och använd sedan en spruta för att extrahera PBS. Sätt in nålen i benmärgshåligheten från båda ändarna av benet och spola upprepade gånger benmärgen i odlingsskålen tills benet blir helt vitt.
4) Samla upp benmärgssuspensionen och filtrera bort små fragment och muskelvävnad med ett 200-mesh nylonnät.
5) Centrifugera filtratet vid 1200 rpm för 5 min och kassera supernatanten.
6) Tillsätt 2 ml ammoniumklorid lyseringsbuffert för röda blodkroppar (1x), återsuspendera cellerna och inkubera vid rumstemperatur i 3-5 min, upp till 10 min.
7) Tillsätt 10 ml PBS för att neutralisera effekten av lyseringsbufferten, centrifugera sedan vid 1200 rpm för 5 min och kassera supernatanten.
8) Tvätta en gång med PBS och återsuspendera sedan cellerna i RPMI1640-odlingsmedium innehållande 10% FBS. Benmärgsceller från mus har erhållits.
Beredning av ammoniumkloridlösning av röda blodkroppar:
a. Förbered 10x förvaringslösning enligt följande: väg 82,9 g NH4Cl, 10,0 g KHCO3 och 0,37 g Na2EDTA, lös i 1 L destillerat vatten, filtrera med 0,22 μm filtermembran för att sterilisera och förvara vid 4 ℃ i 6 månader;
b. Före användning, späd 10x förvaringslösning med sterilt destillerat vatten 1:9 till 1x arbetslösning.
[Notera] Eftersom ammoniumkloridlösning av röda blodkroppar har en viss skadlig effekt på benmärgsceller, bör hemolystiden förkortas så mycket som möjligt.
3.1.2 Induktion av BMDC-differentiering
1) Räkna benmärgscellerna från musen som erhölls i steg 1 och justera cellkoncentrationen till 0,5-1 × 106/ml med RPMI 1640 komplett odlingsmedium innehållande 10 % FBS.
2) Platta i en odlingsplatta med 24 brunnar, 1 ml celler per brunn, tillsätt rekombinant mus GM-CSF (20 ng/mloch IL-4 (10 ng/ml), och odling i en 37℃, 5% CO2 inkubator. Detta är kulturens 0:e dag.
【Notera】
a. Generellt cirka 4-5x107 benmärgsceller kan skördas från en mus, så minst 40-50 brunnar av en 24-brunnars platta kan pläteras.
b. Koncentrationsintervallen för GM-CSF och IL-4 är 20-50 ng/ml och 10-40 ng/ml, respektive.
3) Skaka försiktigt odlingsplattan varannan dag, ersätt sedan 3/4 av volymen med färskt odlingsmedium och fyll på med cytokiner.
4) Mellan den 5:e och 8:e dagen blåser du försiktigt odlingsmediet för att samla upp suspenderade celler och löst fästa celler.
5) Centrifugera vid 1200 rpm för 5 min och kassera supernatanten.
6) Återsuspendera cellerna i RPMI 1640 komplett odlingsmedium innehållande 10% FBS och räkna dem, justera sedan cellkoncentrationen till 1×106/ml och tillsätt rekombinant mus GM-CSF (20 ng/mloch IL-4 (10 ng/ml).
7) Platta cellerna i 100 mm odlingsskålar (upp till 10 ml per skål) eller odlingsplattor med 6 brunnar (2 m/brunn).
8) Fortsätt att odla i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 1-2 dagar.
9) Samla de suspenderade cellerna, som är de mer mogna BMDC:erna.
【Notera】
a. Steg 2.5-2.8 är ompläteringssteg, vars syfte är att göra BMDC erhållen i steg 2.4 mer mogen.
b. Inom 3 timmar efter omplätering kan många taggiga vidhäftande celler ses migrera från DC-klustren, och efter 1 dags odling kommer dessa vidhäftande celler att visa sig lossna från botten av odlingsplattan, och många typiska DC kan ses flyta i odlingsmediet.
3.1.3 Full mognad av BMDC
[Notera] BMDC:erna som erhölls i steg 2 är inte helt mogna DC:er. Om du vill få fullt mogna DC:er måste du fortfarande induceras av LPS, CD40L eller TNF-a.
1) Centrifugera BMDC erhållen i steg 2.4 eller 2.9 vid 1200 rpm för 5 min och kassera supernatanten.
2) Återsuspendera fällningen med RPMI komplett odlingsmedium innehållande rekombinant mus GM-CSF (20 ng/mloch IL-4 (10 ng/ml), och justera cellkoncentrationen till 1×106/ml efter räkning.
3) Lägg till odlingsplattor med 24 brunnar och tillsätt mognadsinducerare som TNF-α (250 U/ml), LPS (1 μg/ml), eller CD40L (1 μg/ml).
4) Odling i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 2 dagar.
5) Samla upp de suspenderade cellerna och cellerna som växer löst fästa vid väggen, som är mogna dendritiska celler.
3.2【BMDC massproduktionsmetod】-Sonmetoden
【Bakgrund】
a. Denna metod kan erhålla 30-40×106 DC/mus inom 7 dagar, vilket är 7-10 gånger så mycket som Inaba klassiska metoden. Efter att DC centrifugerats genom 14,5% metrizamidgradient kan renheten (dvs CD11c+/I-Ab+-celler) nå 85-95%.
b. Endocytosförmågan hos DC som erhålls med denna metod är svagare än den för Inaba klassiska metoden, men mängden IL-12p70 som utsöndras är liknande.
c. DC som erhålls med denna metod har starkare stimuleringsförmåga i blandad lymfocytreaktion än Inaba klassiska metoden.
d. DC som erhålls med denna metod kan inducera starkare specifikt T-cellssvar.
e. Sammanfattningsvis kan Son-metoden få mer och mer mogen BMDC än den klassiska metoden.
【Odlingssteg】
3.2.1 Skaffa benmärgsceller från mus
Se motsvarande steg i Inaba-metoden (modifierad).
3.2.2 Beredning av stora mängder BMDC
1) Räkna benmärgscellerna från musen som erhölls i steg 1 och justera cellkoncentrationen till 2×105/ml med RPMI 1640 komplett odlingsmedium innehållande 10 % FBS.
2) Sprid ut på odlingsplattor med 6 brunnar, 5 ml celler per brunn, tillsätt rekombinant mus GM-CSF (1000 U/mloch IL-4 (1000 U/ml), och odling i en 37℃, 5% CO2 inkubator.
3) På den 4:e odlingsdagen, komplettera odlingssystemet med rekombinant mus GM-CSF (1000 U/mloch IL-4 (1000 U/ml).
4) Samla DCs på den 7:e odlingsdagen, återsuspendera med 2-4 ml RPMI 1640 komplett odlingsmedium, tillsätt till en lika stor volym av 14,5 % (vikt/volym) mepanema och centrifugera vid rumstemperatur i 20 min vid 1200xg.
5) Samla upp mittskiktet och tvätta det tre gånger med RPMI 1640 komplett odlingsmedium för senare användning.
[Notera] DC vid denna punkt är en omogen BMDC. Om du vill mogna den ytterligare, gå till steg 3.
3.2.3 Full löptid för BMDC
1) Återpläterade BMDCs som samlades in i steg 2.4 och tillsatte rekombinant mus GM-CSF (1000 U/mloch IL-4 (1000 U/ml), såväl som LPS (1-10 μg/ml) till kultursystemet
2) Odlad i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 2 dagar för att erhålla mogna BMDCs.
3.3【BMDC massberedningsmetod】-Lutz-metoden
【Bakgrund】
a. Lutz-metoden liknar Son-metoden och båda metoderna kan förbereda BMDC i stora mängder, men Lutz-metoden används mer än Son-metoden.
b. Denna metod kan få mer BMDC, upp till 1-3 x 108 DC/mus, och renheten kan nå 90-95%;
c. Cytokinkoncentrationen som används i denna metod är mycket lägre än den för Son-metoden, endast 200 U/ml, och det sjunker till 30-100 U/ml från den 8:e till den 10:e odlingsdagen, vilket avsevärt kan spara reagenskostnaden;
d. Den största skillnaden mellan denna metod och Inaba classic-metoden och Son-metoden är att benmärgscellerna odlas i en bakterieodlingsskål (petriskål) istället för en cellodlingsplatta. Inaba förklarade att bakteriekulturskålen inte är lätt för makrofager i benmärgen att fästa vid väggen, och därigenom hämmar utvecklingen av makrofager och undviker den hämmande effekten av makrofager på DC-mognad. Detta kan vara huvudorsaken till att denna metod kan erhålla ett stort antal BMDC:er vid en lägre pläteringsdensitet.
e. Men odlingstiden för denna metod är relativt lång och kräver 10-12 dagar. Å ena sidan är detta för att få fler BMDC. Å andra sidan är de flesta granulocyter och lymfocyter svåra att överleva under så lång tid, så renheten hos de BMDC som slutligen erhålls kan förbättras;
f. Denna metod använder endast GM-CSF för induktionsodling, och de erhållna BMDC:erna innehåller både omogna och mogna DC:er. För att ytterligare förbättra mognaden behöver LPS eller TNF-α användas i ytterligare 1-2 dagars induktion, och innehållet av mogna DC-celler kommer att nå 50-70%.
【Odlingssteg】
3.3.1 Skaffa benmärgsceller från mus
Se motsvarande steg i Inaba-metoden (modifierad), och notera att hemolyssteget bör utelämnas.
3.3.2 Storskalig beredning av BMDC
1) Räkna benmärgscellerna från musen som erhölls i steg 1 och justera cellkoncentrationen till 2×105/ml med RPMI 1640 komplett odlingsmedium innehållande 10% FBS;
2) Sprid ut i 100 mm bakteriekulturskålar (petriskål), 10 ml celler per skål, och tillsätt rekombinant mus GM-CSF (200 U/ml), och odling vid 37 ℃, 5 % CO2-inkubator;
[Notera] Bakterieodlingsskålar används här, inte cellodlingsplattor.
3) På den 3:e dagen, tillsätt 10 ml komplett odlingsmedium innehållande 20 ng/ml rekombinant GM-CSF från mus till odlingsskålen;
4) På den 6:e och 8:e dagen, byt hälften av mediet, det vill säga samla upp det gamla odlingsmediet, återsuspendera cellpelleten med komplett odlingsmedium innehållande 20 ng/ml rekombinant mus GM-CSF efter centrifugering, och sätt sedan tillbaka cellsuspensionen i den ursprungliga skålen;
5) På den 10:e dagen kan cellerna samlas in, som är BMDC.
3.3.3 Full mognad av BMDC
1) Samla upp de suspenderade cellerna genom att försiktigt blåsa DCs på den 10:e odlingsdagen med en pipett och centrifugera vid 300xg i 5 minuter vid rumstemperatur;
2) Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten med 10 ml RPMI 1640 komplett odlingsmedium och sprid den sedan på en 100 mm cellodlingsplatta;
3) Lägg till rekombinant mus GM-CSF (100 U/mloch TNF-a (500 U/ml) eller rekombinant mus GM-CSF (100 U/ml) och LPS (1 μg/ml);
4) Fortsätt att odla i en 37℃, 5% CO2 inkubator i 1-2 dagar.
4. Identifiering av BMDC
l Morfologisk observation: De flesta BMDC växer i kolonier, och cellerna har flera dendritiska utsprång, som är mer uppenbara i mogna BMDCs.
l Cellfenotypanalys: Flödescytometri användes för att detektera uttrycket av CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC klass II-molekyler (IA/IE) på ytan av DC-celler. BMDCs uttrycker i hög grad dessa molekyler, och uttrycket av dessa molekyler i fullt mogna BMDCs kommer att ökas ytterligare.
l Blandad lymfocytreaktion (MLR): BMDC har stark stimulerande förmåga, och ju högre mognad desto starkare stimulerande förmåga.
5. Hur väljer man en mognadsinducerare?
LPS, CD40L och TNF-α är ofta använda och effektiva mognadsinducerare för både human DC och mus DC. TNF-a har den svagaste förmågan att inducera DC-mognad av de tre. LPS och CD40L är båda starka inducerare för DC full mognad in vitro. Mognaden av DC inducerad av båda är liknande, men det inducerade cytokinspektrumet är olika. CD40L-inducerad mogen BMDC visar den starkaste immunreglerande förmågan in vivo, inklusive generering av skyddande och terapeutiska tumörimmunsvar. Koncentrationen som används för att stimulera DC full mognad med LPS är i allmänhet 1-10 μg/mL, men i själva verket har 0,1 μg/mL en mycket stark effekt, men för försäkringsändamål, 1 μg/mL används vanligtvis. Det bör noteras att CD40L-molekyler tillhör TNF-ligandfamiljen, som kännetecknas av att de endast kan fungera efter att trimerer har bildats. Därför är det bäst att använda rekombinant CD40L-trimerprotein för att stimulera DC, vilket kommer att ha god effekt. Om CD40L-monomerer används för att stimulera DC är mognaden i de flesta fall inte särskilt hög.
6. Val av träningsmetod
Tabell 1.Jämförelse av tre vanliga experimentella metoder för att framställa BMDC
| Parameter | Klassisk BMDC-odlingsmetod - Inaba-metoden | Storskalig framställning av BMDC - Son-metoden | Storskalig framställning av BMDC - Lutz-metoden |
| Antal citeringar i PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Benmärgshemolys, lys av röda blodkroppar | JA | JA | Inga |
| Benmärg tar först bort lymfocyter | JA | Inga | Inga |
| Borttagning av granulocyter under odling | JA | Inga | Inga |
| Initial pläteringsvolym av benmärgsceller | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Inkubator | 24-brunnars cellodlingsplattor | 6-brunnars cellodlingsplatta | 100 mm bakterieodlingsskål |
| Kulturmedium | RPMI 1640+10 % FCS | ||
| Koncentration av mus GM-CSF | 200-1000 U/ml | Den initiala tillsatta koncentrationen är 125-1000 U/ml På den 4:e och 7:e dagen tillsätts tillräckliga mängder GM-CSF och IL-4 till odlingssystemet. | Den initiala tillsatta koncentrationen är 200 U/ml.3-100 U/ml efter den 10:e dagen |
| Mus IL-4 | Behöver inte | Behov，Koncentrationen är densamma som GM-CSF | Behöver inte |
| Vätskebytesmetod | På den 2:a och 4:e dagen, kassera 50%-75% av det gamla odlingsmediet (som innehåller celler) och ersätt med nytt komplett odlingsmedium som innehåller tillräckligt med GM-CSF. | / | På den 3:e dagen tillsattes en lika stor volym komplett odlingsmedium innehållande GM-CSF. Den 6:e, 8:e och 10:e dagen byttes hälften av mediet ut. Det gamla odlingsmediet (innehållande celler) aspirerades, centrifugerades, återsuspenderades i färskt komplett odlingsmedium innehållande GM-CSF och placerades sedan tillbaka. |
| Kulturtid före passage (expansion) | 6 dagar | 7 dagar | 10 dagar |
| Odlingstid efter passage (mognad) | 2 dagar | Ingen | 1-2 dagar |
| Full mognadsinducerare | TNF-ɑ(250 U/ml） | LPS(1-10 μg/ml) | TNF-ɑ(250 U/ml）eller LPS(1 μg/ml) |
| Tidpunkt för skörd av DC-celler | 7-8 dagar | 7-8 dagar | 10-13 dagar |
| DC Purity | Dag 8:60-70 % | Dag 7:85-95 % | Dag 10-12:80-90 % |
| DC produktion/mus | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Rekommenderade DC-odlingsreagenser
| Produktnamn | Katt | Storlek |
| 91108ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |