1.Bakgrund av Laminin 521
Laminin 521 (LN521) är ett nyckelcellsadhesionsprotein i den naturliga stamcellsnischen och en matris för odling och expansion av mänskliga embryonala (hES) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC). LN521 binder till cellytreceptorer och aktiverar cellsignaleringsvägar, vilket resulterar i produktion av mer funktionella celler.
Laminin 521 reproducerar den biologiskt relevanta hPSC-miljön in vitro, främjar vidhäftning, hög överlevnad och stark långsiktig självförnyelse av hPSC, och är ett nyckelmatrisprotein som stöder stamcellstillväxt och upprätthåller stabiliteten i basalmembranstrukturen och prestanda. Laminin 521 är också en av de mest använda näringsfria odlingsmatriserna. Dessutom kan Laminin 521 uppnå effektiv encellspassage av genetiskt stabila och pluripotenta stamceller utan tillsats av några apoptoshämmare. Cellerna växer i ett enhetligt monolager utan att man behöver ta bort några differentieringsområden manuellt. Dessutom har studier visat att LN521 kan stödja PSC-tillväxt i mer än 10 generationer utan några tecken på karyotypavvikelser, och upprätthåller förmågan hos PSC att differentiera i de tre groddlagren i de inre, mellersta och yttre groddlagren.
Figur 1. Laminin 521-struktur [1]
2. Lamininbeläggningsexperiment
2.1 Bered laminin 521 till 400 µg/ml med sterilt avjoniserat vatten eller vatten för injektion. Det rekommenderas att ytterligare späda till 100 µg/ml med steril 1×DPBS (Ca++/Mg++) före användning, och sedan späda till en arbetskoncentration av 5-10 µg/ml med steril DPBS (Ca++/Mg++). Beläggningskoncentrationen varierar beroende på typen av odlade celler, och det rekommenderas att optimera det experimentella protokollet för att bestämma den optimala beläggningskoncentrationen för cellerna. Se tabell 1 för rekommenderade koncentrationer.
Notera: DPBS innehållande Ca2+ och Mg2+ bör användas, eftersom tvåvärda katjoner är viktiga för proteinstruktur och funktion. Den erforderliga arbetskoncentrationen av Laminin 521 beror på cellerna och applikationen. Vi rekommenderar en initial beläggningskoncentration på 0,5 μg/cm2.
Tabell 1. Rekommenderade volymer av rekombinant humant laminin arbetslösning för olika odlingskärl.
| Petriskål | Beläggningskoncentration (μg/mL) | Tilläggsbelopp på LN521 | Tilläggsbelopp på 1*DPBS | Total volym |
| 6 väl | 5 | 50 μL/brunn | 950 μL/brunn | 1 ml/brunn |
| 12 väl | 5 | 25 μL/brunn | 475 μL/brunn | 0,5 ml/brunn |
| 24 väl | 5 | 15 μL/brunn | 285 μL/brunn | 0,3 ml/brunn |
| 48 väl | 5 | 7,5 μL/brunn | 142,5 μL/brunn | 150 μL/brunn |
| 96 väl | 5 | 3,5 μL/brunn | 66.5 μL/brunn | 70 μL/brunn |
| 35 mm petriskål | 5 | 50 μL/brunn | 950 μL/brunn | 1 ml/brunn |
| 60 mm petriskål | 5 | 100 μL/brunn | 1900 μL/brunn | 2 ml/brunn |
| 100 mm petriskål | 5 | 300 μL/brunn | 5700 μL/brunn | 6 ml/brunn |
Ovanstående volym är baserad på en beläggningskoncentration på 5μg/mL.
2.2 Tillsätt den specificerade volymen laminin-DPBS-blandning till varje brunn och skaka försiktigt. Se till att hela ytan är täckt med lamininbeläggningslösning, eftersom obelagda ytor inte stödjer celltillväxt.
2.3. Placera plattan i en 37°C inkubator och inkubera över natten. Den minsta inkubationstiden är 2 timmar, men inkubation över natten rekommenderas för att erhålla idealiska cellodlingsförhållanden. Var noga med att inte låta odlingsbehållaren torka ut, vilket kommer att inaktivera LN521.
2.4. När cellerna är redo att ympas, aspirera laminin 521-lösningen.
3.iPSC-kultur
3.1 iPSC-upptining (med 12-brunnars platta som ett exempel)
3.1.1 Ta bort iPSC från flytande kväve eller torris och tina i 37°C vatten i 10 sekunder.
3.1.2 Sterilisera kryovialerna med 75 % alkohol och överför dem till en arbetsyta.
3.1.3 Överför cellerna till ett nytt 15 mL centrifugrör innehållande 9 mL DMEM-F12.
3.1.4 Centrifugera 15 mL centrifugröret vid 300 g i 5 minuter vid rumstemperatur.
3.1.5 Kassera lamininlösningen från den belagda plattan med 12 brunnar.
3.1.6 Kassera cellsupernatanten och återsuspendera försiktigt iPSC:erna i 1 mL mTeSR-plus (innehållande 10 µM Y-27632) och överför dem till den belagda plattan med 12 brunnar. Skaka plattan för att jämnt fördela cellerna till en slutlig celldensitet på 1×10^5 celler/brunn och låt stå i rumstemperatur i 10 minuter. Se till att kulturen passeras inom 4-5 dagar.
3.1.7 Återför 12-brunnars plattan till 37°C inkubatorn för inkubation.
3.1.8 Odlingsmediet som innehåller ROCK-hämmare ska avlägsnas efter 12-16 timmar och fortsätta att odlas i mediet utan inhibitor.
Tabell 2. Cellsåddstäthet i olika odlingskärl, cellantal bestämt enligt celltillväxthastighet
| Cellodlingskärl | 6 väl | 12 väl | 24 väl | 96 väl |
| Cellnummer | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. iPSC Passaging Protocol
3.2.1 Kassera odlingssupernatanten och skölj med 1 mL PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Notera: Använd PBS utan Ca2+ och Mg2+, eftersom tvåvärda katjoner har en negativ effekt på vissa dissociationsenzymer.
3.2.2 Kassera PBS och tillsätt 0,5 mL Gentle Cell Dissociation Reagent.Inkubera i rumstemperatur i 6-8 minuter eller observera under ett mikroskop tills cellerna inte längre är bundna till plattan.
3.2.3 Tillsätt en lika stor volym DMEM-F12, blanda försiktigt cellerna, överför till ett centrifugrör vid rumstemperatur och centrifugera vid 300 g i 5 minuter.
3.2.4 Förbered en lamininbelagd platta med 12 brunnar innan cellerna passerar.
3.2.5 Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i mTeSR-plus-medium innehållande 10 µM Y‑27632.
3.2.6 Överför cellerna till den förberedda lamininbelagda plattan med 12 brunnar. Skaka plattan försiktigt för att fördela cellerna jämnt och låt stå i rumstemperatur i 10 till 20 minuter.
3.2.7 Placera plattan med 12 brunnar i en 37°C inkubator och inkubera.
Notera: iPSCs kommer snabbt att differentiera och dö efter att ha växt till ett monolager. För att upprätthålla tillväxt och pluripotens måste de passeras innan de är sammanflytande.
3.3. Kryokonservering av iPSC
3.3.1 Förbered det milda celldissociationsreagenset.
3.3.2 Utför cellseparation enligt iPSC-passeringsprotokollet, använd cellorganellräkningen för att säkerställa celldensiteten före kryokonservering.
3.3.3 Varje rör med celler bör frysas med en celldensitet på 1-2×10^6. Följ stegen för centrifugering och avlägsnande av cellodlingsmedium i iPSC-passageprotokollet. Återsuspendera den isolerade iPSC-pelleten i en lämplig volym kryokonserveringslösning
3.3.4 Tillsätt 1 mL återsuspenderad cellkryokonserveringspellet till ett 1,5 mL kryokonserveringsrör, utför programkylning och överför sedan till flytande kväve för långtidsförvaring.
4. Viktiga anmärkningar om lamininbeläggning
4.1. Alla steg i det experimentella protokollet måste utföras under sterila förhållanden.
4.2. Undvik att utsätta laminin för rumstemperatur under lång tid.
4.3. Undvik upprepad frysning och upptining
4.4. Efter upptining kan den outspädda proteinstamlösningen förvaras vid 2~8 ℃ under sterila förhållanden och kan lagras stabilt i minst 3 månader.
5.Relaterad produktinformation
| Produktnamn | Katt# | Storlek |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referenser
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Kristallografisk analys av laminin β2-kortarmen avslöjar hur LF-domänen infogas i en vanlig array av LE-domäner. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.