Ct-värdet är en avgörande resultatrepresentation vid fluorescerande kvantitativ PCR. Den används för att beräkna skillnader i genuttrycksnivåer eller genkopietal. Så, vilket intervall av Ct-värden kan anses rimligt vid fluorescerande kvantifiering? Hur kan vi säkerställa att Ct-värdena faller inom ett effektivt intervall? Låt oss idag låta Xiao Yi svara på denna fråga för alla.
Vad är Ct-värdet?
I qPCR-amplifieringsprocessen hänvisar Ct-värdet till antalet amplifieringscykler (Cycle Threshold) vid vilka fluorescenssignalen för den amplifierade produkten når det inställda fluorescenströskelvärdet. "C" står för cykel och "T" står för tröskel. Enkelt uttryckt är Ct-värdet antalet cykler det tar för startmallen i qPCR att nå en viss mängd produkt, vilket kommer att förklaras ytterligare senare.
Vilken funktion har Ct-värdet?
1. Samband mellan exponentiell amplifiering, mallkvantitet och Ct-värde
I ett idealiskt scenario, under qPCR, amplifieras gener exponentiellt och ackumuleras under ett visst antal cykler. Förhållandet mellan antalet amplifieringscykler och mängden produkt kan uttryckas som: mängden amplifierad produkt = initial mallkvantitet ×(1 + En)^antal cykler. Men qPCR-reaktioner inträffar inte alltid under ideala förhållanden. När mängden amplifierad produkt når en "viss produktkvantitet" är antalet cykler vid denna punkt Ct-värdet, vilket indikerar perioden för exponentiell amplifiering. Förhållandet mellan Ct-värdet och den initiala mallkvantiteten är som följer: det finns ett linjärt samband mellan Ct-värdet för en mall och logaritmen för det initiala kopienumret för den mallen. En högre koncentration av initial mall resulterar i ett lägre Ct-värde, medan en lägre koncentration av initial mall leder till ett högre Ct-värde.
2. Amplifieringskurva, fluorescenströskel och en viss produktkvantitet
Mängden qPCR-amplifieringsprodukter representeras direkt i form av fluorescenssignaler, som är känd som amplifieringskurvan. I de tidiga stadierna av PCR, när amplifieringen är under idealiska förhållanden och antalet cykler är lågt, är ackumuleringen av produkter minimal, och nivån av producerad fluorescens är inte signifikant särskiljbar från bakgrundsfluorescensbruset. Därefter går produktionen av fluorescens in i den exponentiella fasen. Mängden PCR-produkt kan detekteras vid en viss tidpunkt när reaktionen just går in i den exponentiella fasen, vilket kallas "vissa produktkvantiteter". Detta kan användas för att härleda mallens initiala innehåll. Därför är fluorescenssignalintensiteten som motsvarar en viss produktkvantitet känd som fluorescenströskeln.
I de senare stadierna av PCR uppvisar amplifieringskurvan inte längre exponentiell amplifiering och går in i den linjära fasen och platåfasen.
3. Reproducerbarheten av Ct-värden
När PCR-cyklerna når antalet cykler vid vilka Ct-värdet uppträder, går den precis in i den sanna exponentiella amplifieringsfasen. Vid denna tidpunkt har mindre fel inte förstärkts, så reproducerbarheten av Ct-värden är utmärkt. Detta betyder att oavsett om samma mall amplifieras vid olika tidpunkter eller i olika rör samtidigt, förblir de erhållna Ct-värdena konstanta.
Vad är intervallet för Ct-värden?
1. Amplifieringseffektivitet Sv
PCR-amplifieringseffektivitet avser effektiviteten med vilken polymeraset omvandlar målgenen till amplifieringsprodukter.Amplifieringseffektiviteten är 100 % när en DNA-molekyl omvandlas till två DNA-molekyler. Amplifieringseffektivitet betecknas vanligtvis som En. För att underlätta analysen i efterföljande artiklar följer här en kort introduktion till de faktorer som påverkar amplifieringseffektiviteten.
| Påverkande faktorer | Förklaring | Domar |
| A. PCR-hämmare | 1. Mall-RNA:t kan innehålla ämnen som hämmar PCR-reaktionen, såsom proteiner eller tvättmedel, bland annat. 2. Det cDNA som erhålls efter omvänd transkription kan innehålla höga koncentrationer av mall-RNA och komponenter av omvänd transkriptionsreagens, vilket också kan hämma efterföljande PCR. | 1. Förekomsten av kontaminering kan bedömas genom att mäta förhållandena A260/A280 och A260/A230 eller genom att utföra RNA-elektrofores. 2. Efter omvänd transkription, om cDNA är utspädd i en viss proportion. |
| B. Orimlig primerdesign | Primer kan inte härda effektivt. | Kontrollera om det finns dimerer eller hårnålsstrukturer i primrarna, och om det finns felmatchningar; ibland är det nödvändigt att vara uppmärksam på designen som spänner över introner. |
| C. Olämpligt reaktionsförfarande | 1. Primerna kan inte härda effektivt. 2. Aktiviteten hos DNA-polymeras frisätts inte helt. 3. På grund av långvariga höga temperaturer minskar aktiviteten hos DNA-polymeras. | 1. Glödgningstemperaturen är högre än primerns Tm-värde. 2. Fördenatureringstiden är för kort. 3. Varaktigheten av varje steg i reaktionsprotokollet är för lång. |
| D.Reagenser inte blandade noggrant eller pipetteringsfel | I reaktionssystemet är den lokala koncentrationen av PCR-reaktionskomponenter för hög eller ojämn, vilket resulterar i icke-exponentiell amplifiering av PCR. | / |
| E. Amplicon längd | Amplikonlängden är för lång och överstiger 300 baspar, vilket resulterar i låg amplifieringseffektivitet. | Kontrollera om amplikonlängden är mellan 80 baspar och 300 baspar. |
| F. Effekten av qPCR-reagenser | En lägre koncentration av DNA-polymeras i reagensen eller suboptimala jonkoncentrationer i bufferten resulterar i att Taq-enzymet inte når sin maximala aktivitet. | Standardkurvan används för att mäta amplifieringseffektiviteten för primrarna. |
2.Omfånget av Ct-värden
Intervallet för Ct-värden är 15-35. Ett Ct-värde mindre än 15 anses ligga inom baslinjefasen och har inte nått fluorescenströskeln. Helst finns det ett linjärt samband mellan Ct-värdet och logaritmen för mallens initiala kopianummer, vilket är känt som standardkurvan. Med hjälp av standardkurvan, när amplifieringseffektiviteten är 100 %, beräknas Ct-värdet för att kvantifiera en enstaka kopia av genen till cirka 35. Om Ct-värdet är större än 35, teoretiskt sett, är det initiala kopiantalet för mallen mindre än 1, vilket kan anses vara statistiskt insignifikant.
För olika gener kräver Ct-värdesintervallet, på grund av variationer i den initiala mallmängden av genkopior och amplifieringseffektivitet, skapandet av en standardkurva för den genen för att beräkna det linjära detektionsintervallet för genen.
3.Faktorer som påverkar Ct-värden
Som framgår av förhållandet mellan antalet amplifieringscykler och mängden produkt: Amplifieringsproduktmängd = Initial mallmängd × (1 + En)^antal cykler, kan det ses att under ideala förhållanden kommer den initiala mallmängden och En att påverka Ct-värdet. Skillnader i mallkvalitet eller amplifieringseffektivitet kan göra att Ct-värdet blir för högt eller för lågt.
4. Ct-värden är för höga eller för låga
Xiao Yi rådfrågade experterna på vårt företags tekniska avdelning och sammanfattade orsakerna och lösningarna för de två vanliga typerna av problem med Ct-värden för att upplysa våra läsare.
| Problem | Orsaker | Lösningar |
| Ct-värdet för högt | Mallkoncentrationen är låg eller så finns PCR-hämmare. Amplifieringseffektiviteten är låg. | 1. Öka mallkoncentrationen; eller öka utspädningsförhållandet av RNA eller cDNA; eller förbered mallen igen. 2. Sänk glödgningstemperaturen eller använd en tvåstegsförstärkningsmetod; se till att komponenterna och systemet blandas ordentligt; optimera reaktionsprotokollet; eller prova att byta ut reagenserna. |
| Ct-värdet för lågt | 1. Hög mallkoncentration 2. Kontaminering i NTC (ingen mallkontroll) och NRC (ingen omvänd kontroll) 3. Olämplig primerdesign | 1. Minska mängden mall-RNA; eller späd ut cDNA vid ett högre förhållande. 2. Byt ut alla reagenser på nytt; eller använd UDGase antikontamineringsreagenser. 3. Optimera proceduren för att undvika ospecifik amplifiering. |
Detta avslutar analysen av det onormala Ct-värdet som orsakar detta problem. Därefter kommer Xiao Yi att rekommendera en rad kostnadseffektiva produkter för att säkerställa att dina experimentella data är mer exakta och tillförlitliga. Kom och välj dina favoriter!
| Produktnamn | Katt# | Storlek |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix för qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast One-steps RT-gDNA Digestion SuperMix för qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (ingen färgämne) | 11150ES60 | 100 T |