Fluorescerande kvantitativ PCR (qPCR) är en allmänt använd teknik i laboratorier, som kan användas för genuttrycksanalys, genotypning, patogendetektion, SNP-analys med mera. Driften av qPCR är enkel och dess princip är lätt att förstå. Nu, inför en hög med rörig data, blir hur man analyserar resultaten en skrämmande uppgift. Idag kommer Xiao Yi att guida dig om hur du förenklar komplexa processer och enkelt skaffar data som kan publiceras i SCI-tidskrifter!
Vanliga analysmetoder som används i qPCR inkluderar relativ kvantifiering och absolut kvantifiering, och valet mellan dessa metoder bör baseras på olika experimentella design. I det här numret kommer vi att fokusera på en vanlig tillämpning av qPCR——genuttrycksanalys, där den relativa kvantifieringsmetoden i allmänhet väljs.
Experimentell design
Antag att vi för närvarande behöver studera effekten av ljusinduktion på uttrycket av Arabidopsis AtSUC2-genen. Kontrollgruppen skulle bestå av Arabidopsis-växter som inte genomgått någon behandling, medan försöksgruppen skulle vara växter som behandlats med en viss ljusinduktion. RNA skulle extraheras från båda grupperna och omvänd transkriberas för att erhålla cDNA, som sedan skulle användas som en mall. Arabidopsis GAPDH-genen skulle väljas som en intern referens för qPCR-experimentet.
qPCR-brunnarna som behöver ställas in är följande:
1) NTC (Ingen mallkontroll) används för att verifiera om det finns kontaminering i PCR-systemet.
2) NRT (Ingen omvänd transkription) hänvisar till att använda RNA som inte har genomgått omvänd transkription som mall, vilket fungerar som en kontroll för gDNA-kontamination.
3) Den intern referensgen används för att korrigera för skillnader orsakade av varierande initialkoncentrationer av prover.
4) Valet av kontrollprover faller vanligtvis i följande kategorier:
- För att bedöma effekten av en viss behandling på genuttrycket används det obehandlade provet som referensprov.
- För att detektera skillnaderna i genuttryck vid olika tidpunkter används provet vid tidpunkten 0 som referensprov.
- För att jämföra skillnaderna i genuttryck mellan olika vävnader väljs en vävnad godtyckligt ut som referensprov.
En punkt att notera här är att för varje material som nämns ovan har 3 PCR-brunnar (1, 2, 3) satts upp. Dessa är PCR-duplikat, även kända som tekniska replikat, som är avsedda att eliminera driftsfel och noggrant utvärdera amplifieringseffektiviteten. Dessutom måste biologiska replikat etableras, vilket innebär att man genomför samma experiment på olika material (olika tider, växter, partier, reaktionsplattor) för att kalibrera biologisk variabilitet och analysera om behandlingen har statistisk signifikans. Specifikt i detta fall kräver både experimentgruppen och kontrollgruppen minst två uppsättningar av Arabidopsis-prover (A, B, C) för att bearbetas. RNA extraheras från varje uppsättning och omvänd transkriberas, följt av qPCR. För statistisk analys används medelvärdet av de tre biologiska replikaten.
Resultatanalys — ΔΔCt-metod
Kännetecknande för ΔΔCt-metoden är att den enbart förlitar sig på Ct-värdena för beräkning, men förutsättningen är att amplifieringseffektiviteten för målgenen och referensgenen ska vara relativt konsekvent och båda falla inom intervallet 90-110%.
Den specifika beräkningsformeln är som följer:
ΔCt = Ct (målgen) - Ct (referensgen)
ΔΔCt = ΔCt (experimentell grupp) - ΔCt (kontrollgrupp)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Om man antar att ovanstående experiment studerar effekten av ljusinduktion på uttrycket av Arabidopsis AtSUC2-genen, är resultaten av qPCR som följer:
Under beräkningen beräknar vi först medelvärdet av 2^-△Ct-data för kontrollgruppen (som visas i figuren ovan, vilket är 0,00116). Sedan dividerar vi varje värde på 2^-△Ct med detta medelvärde för att få värdet på 2^-△△Ct. Slutligen organiserar vi dessa värden för att erhålla medelvärdet och standardavvikelsen, vilket indikerar att uttrycksnivån för målgenen i experimentgruppen ökas med cirka 9,73 gånger jämfört med kontrollgruppen.
Resultaten plottas med programvaran Graphpad enligt följande:
P-värdet beräknat med hjälp av programvarans t-test är 0,0024, vilket är mindre än 0,05, vilket indikerar en statistiskt signifikant skillnad och resultaten är tillförlitliga.
Resultatanalys — Dual Standard Curve Method
I praktiska tillämpningar, eftersom amplifieringseffektiviteten för målgenen och referensgenen ofta är olika, är det nödvändigt att omdesigna primers och optimera reaktionsförhållandena för att uppnå samma amplifieringseffektivitet. Men vi kan också välja en mer bekväm metod, den dubbla standardkurvan.
Låt oss här först förstå analysmetoden för absolut kvantifiering. De specifika stegen är att amplifiera målfragmentet genom PCR, sedan infoga målfragmentet i en kloningsvektor, extrahera den rekombinanta plasmiden och efter sekvensering bekräftar att den är korrekt, kan den användas som standard. Mängden plasmid-DNA kan mätas med hjälp av instrument som Nanodrop, och kopiantalet omvandlas till specifika plasmidkopior med hjälp av kopietalskonverteringsformeln. Därefter amplifieras DNA:t efter en serie spädningar. En standardkurva plottas med logaritmen för standardkopietalet som x-axel och de uppmätta Ct-värdena som y-axel. Baserat på Ct-värdet för det okända provet kan dess absoluta kopietal beräknas.
Beräkningsformel för kopia:
Kopiantal = (massa ÷ relativ molekylmassa) × 6,02 × 10^23
Metoden med dubbla standardkurvor innebär att separat konstruera standardprover för målgenen och referensgenen, utföra absolut kvantifiering och skapa standardkurvor. Efter att ha beräknat det absoluta kopiantalet för de okända proverna, görs en jämförelse, vilket ger högre noggrannhet.
Den specifika beräkningsformeln är som följer:
Q = Antal målgenkopior / Antal referensgenkopior
RQ = Q (experimentell) / Q (kontroll)
I experimentet som nämns ovan, som undersöker effekten av ljusinduktion på uttrycket av Arabidopsis AtSUC2-genen, konstruerades standardprover för både AtSUC2 och GAPDH, och följande standardkurvor framställdes:
Ct-värdena för målgenen och den interna referensgenen i proverna som ska testas är följande:
Under beräkningen ersätts först Ct-värdena för målgenen och den interna referensgenen i det linjära förhållandet av standardkurvan för att erhålla de absoluta kopietalen för målgenen och den interna referensgenen i både experiment- och kontrollgruppen. Sedan, med hjälp av formeln Q = antal målgenkopior / antal referensgenkopior, normaliseras uttrycksnivån för målgenen.Slutligen, enligt formeln RQ = Q (experimentell) / Q (kontroll), beräknas RQ till 9,71, vilket indikerar att uttrycksnivån för målgenen i experimentgruppen är 9,71 gånger högre än den i kontrollgruppen.
Resultaten plottas med hjälp av programvaran GraphPad enligt följande:
P-värdet beräknat med hjälp av programvarans t-test är 0,0008, vilket är mindre än 0,05, vilket indikerar en statistiskt signifikant skillnad och resultaten är tillförlitliga.
Det avslutar qPCR-dataanalysen för denna session. Därefter kommer jag att rekommendera en rad kostnadseffektiva produkter för att säkerställa att dina experimentella data är mer exakta och tillförlitliga. Kom och hämta dem!
| Produktnamn | Katt# | Storlek |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 ml |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix för qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast One-steps RT-gDNA Digestion SuperMix för qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Hifair™ AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (ingen färgämne) | 11150ES60 | 100 T |