Längden på moget miRNA är bara cirka 20 nt, vanligtvis kommer den framåtriktade primern att täcka sin fulla längd eller till och med ha en överflödig del, och den omvända primern har ingenstans att placeras. Den nuvarande marknadslösningen är att öka längden på det omvända transkriptet under omvänd transkription. Vanliga metoder inkluderar tailing-metoden och stam-loop-metoden.

1. Inledning
2. Rekommenderade produkter
3. Relaterad produktlista

1. Inledning

MikroRNA (miRNA) är enkelsträngade små RNA med en storlek på cirka 21-23 baser, som genereras från enkelsträngade RNA-prekursorer med en hårnålsstruktur på cirka 70-90 baser efter Dicer-enzymbearbetning. miRNA binder huvudsakligen specifikt till 3'-ändens icke-kodande region av målgenens mRNA, och reglerar translationsprocessen av post-transkriptionell målgen mRNA, och blockerar därigenom mRNA-translation och främjar mRNA-nedbrytning, vilket resulterar i minskat proteinuttryck. Rollen för miRNA är involverad i förekomsten och utvecklingen av olika hjärt-kärlsjukdomar såsom ontogeni, vävnadsdifferentiering, cellproliferation och apoptos.

Figur 1. Schematiskt diagram av miRNA-syntes in vivo

Längden på moget miRNA är bara cirka 20 nt, vanligtvis kommer den framåtriktade primern att täcka sin fulla längd eller till och med ha en överflödig del, och den omvända primern har ingenstans att placeras. Den nuvarande marknadslösningen är att öka längden på det omvända transkriptet under omvänd transkription. Vanliga metoder inkluderar tailing-metoden och stam-loop-metoden.

Figur 2. miRNA-syntes genom svansmetoden

Figur 3. miRNA-syntes med stam-loop-metoden

Svansmetoden använder PolyA-polymeras för att lägga till Poly(A)-svans till moget miRNA och använder Oligo-dT med den universella sekvensen som en omvänd transkriptionsprimer för att syntetisera det förlängda miRNA som motsvarar den första strängen av cDNA. Stam-loop-metoden använder den universella sekvensen vikta in i stam-loop-strukturen som en primer för att syntetisera den första strängen av cDNA som motsvarar det förlängda miRNA. Stam-loop-strukturen kommer att öppnas vid en lämplig temperatur under den efterföljande amplifieringsprocessen och kombineras med de relevanta amplifieringsprimrarna.

Tabell 1.Jämförelse av Tailing och Stem-loop

2. Rekommenderade produkter

2.1 Yeasen miRNA tailed inversion kvantitativ kombination (11148ES&11171ES)

Figur 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

Kitet antar tailing-metoden för att omvända transkription av miRNA första-strängs cDNA. 2×Hifair™ miRNA RT-bufferten i produkten innehåller alla råmaterial och primrar för miRNA-svansreaktion och omvänd transkriptionsreaktion, och har noggrant optimerats. Det kan säkerställa att poly(A)-modifierings- och omvänd transkriptionsprocesser av miRNA 3'-änden utförs effektivt samtidigt.

Figur 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

En ny generation av förblandade fluorescenskvantitativa PCR-detektionsreagenser speciellt utvecklade för kvantitativ miRNA-detektion, innehållande speciell ROX Passive Reference Dye, lämplig för alla qPCR-instrument, inget behov av att justera koncentrationen av ROX på olika instrument, bara i beredningsreaktionen Amplifiering kan utföras genom att lägga till primers och mallar till systemet. DNA-polymeraset antar kemiskt modifierat varmstartspolymeras och samarbetar med ett speciellt buffertsystem, vilket gör reaktionsspecificiteten och känsligheten högre och kan kvantifiera exakt i ett bredare intervall.

2.2 Produktens prestanda

2.2.1 Kompatibel med qPCR-instrument för alla plattformar

Figur 6. Kompatibla resultat med olika qPCR-instrument

Med användning av totalt RNA från 293T-celler som mall utfördes omvänd transkription med Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat # 11148ES).Det erhållna cDNA:t späddes 10 gånger och använde sedan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat # 11171ES) för att detektera de interna referensgenerna för hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p respektive U6.

2.2.2 Hög detekteringshastighet, upp till 10 sidor

Figur 7. Amplifieringsdiagram

Figur 8. Amplifieringsdiagram

Användning av syntetiska hsa-miR-let-7e-5p(a) och 293T cell Total RNA(b) som mallar, utspädda till följande gradienter, respektive: 60 kopior till 606 kopior (6 gradienter) och 10 pg-100 ng (5 gradienter), omvänd transkriberad Strand-kit med Synthest Strand™ miDNA (Cat # 11148ES), och det resulterande cDNA:t detekterades med Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat # 11171ES) för hsa-miR-let-7e -5p genuttryck.

2.2.3 Hög specificitet, kan särskilja enstaka basskillnader mellan miRNA i samma familj

Figur 9. Särskilj enstaka basskillnader mellan miRNA

Den mänskliga hsa-let-7-familjen har flera miRNA, med få baser som skiljer sig från varandra, eller till och med bara en enda basskillnad. Syntetiska miRNA för varje Let-7 isoform (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) transkriberades omvänt till cDNA med hjälp av Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat # 11148ES), med användning av Hieff™ miRNA Universal qPCR 1 Amplifier (1C1BR) miRNA separat med olika primers, och beräkna matchningshastigheten med hjälp av ekvation 2-ΔCT x 100%. Resultaten visar att närbesläktade subtyp familjemedlemmar effektivt kan särskiljas.

2.2.4 Utmärkt förstärkningseffektivitet

Figur 10. Amplifieringseffektivitet

Figur 11. Amplifieringseffektivitet

miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p gener amplifierades med användning av humana 293T-celler och muslever Total RNA som mallar. Resultaten visade att jämfört med liknande produkter matchade Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) reaktionssystemet för Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) med utmärkt prestanda.

2.2.5 Utmärkt stabilitet

Figur 12. Produktstabilitetsanalys vid 37 ℃ i 7 dagar

Figur 13. Analys av resultat efter 50 frys-upptiningscykler

Figur 14. Stabila analytiska egenskaper hos det kvantitativa reaktionssystemet vid olika temperaturer under 24 timmar

Omvänd transkription utfördes med Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat # 11148ES) med användning av 293T cell Total RNA som mall, och det erhållna cDNA späddes 10 gånger och detekterades med Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat # 11171ES). Uttryck av hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.

2.3 Yeasen miRNA stam-loop inversion kvantitativ kombination (11139ES&11170ES)

Figur 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

Satsen utvecklades baserat på Hifair™ III omvänt transkriptas.Enzymets cDNA-synteshastighet är snabb och den termiska stabiliteten är avsevärt förbättrad. Samtidigt förstärker enzymet affiniteten med mallen och är lämplig för omvänd transkription av en liten mängd mallar och gener med låg kopia. Förmågan hos Hifair™ III omvänt transkriptas att syntetisera fullängds cDNA har också förbättrats, vilket möjliggör syntes av cDNA upp till 19,8 kb.

Figur 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

Denna produkt är en speciell mastermix för miRNA-kvantifiering med SYBR Green I chimär fluorescensmetod. Eftersom miRNA-sekvenser är korta och miRNA-sekvenser i samma familj ofta är mycket lika, krävs det extremt specificitet under kvantifiering. Denna produkt är baserad på hot-start DNA-polymeras, med optimerad buffert, som kraftigt kan minska ospecifik amplifiering; samtidigt gör den speciella ROX Reference Dye mastermixen lämplig för alla qPCR-instrument, och det finns inget behov av att justera ROX på olika instrument Amplifiering kan utföras genom att lägga till primers och mallar när reaktionssystemet förbereds.

2.3.1 Kompatibel med qPCR-instrument på alla plattformar

Figur 17. Kompatibla resultat med olika qPCR-instrument

Med användning av totalt RNA från musleverceller som mall utfördes omvänd transkription med Hifair™ III 1st Strand
cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat # 11139ES), och det erhållna cDNA späddes 40 gånger och använd Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat # 11170ES) användes för att amplifiera den humana mmu-miR-125a-genen.

2.3.2 Hög känslighet, upp till 10 sidor

Figur 18. Känslighetsdetektering

Med användning av totalt RNA från musleverceller som mall, utfördes omvänd transkription med Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat # 11139ES), och det erhållna cDNA:t späddes seriellt 10 gånger (intervall 10 pg/μL). -0,1 μg/μL), amplifiera generna mmu-miR-125a, mmu-miR-132 och mmu-miR-351 av murint ursprung.

2.3.3 Hög specificitet, kan särskilja enstaka basskillnader mellan miRNA i samma familj

Figur 19. Särskilj enstaka basskillnader mellan miRNA

Den mänskliga hsa-let-7-familjen har flera miRNA, med få baser som skiljer sig från varandra, eller till och med bara en enda basskillnad. Dessa miRNA amplifierades separat med olika primrar med Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat # 11170ES), och matchningshastigheten beräknades med formeln 2^-Δct x 100%.

2.3.4 God repeterbarhet

Figur 20. Upprepningsdetektering

Med användning av det totala RNA:t från humana 293T-celler som en mall för omvänd transkription, utfördes omvänd transkription med Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat # 11139ES), och det erhållna cDNA späddes 50 gånger och användes Hieff™ miRNASYBR # 1CR qP1C Universal Mix för att amplifiera den humana hsa-let-7a-genen i ett 90-brunnars replikatexperiment.

2.3.5 Bra stabilitet

Bild 21.Stabilitetsanalys av 11170ES vid olika temperaturer i 14 dagar

Figur 22. Analys av 11170ES upprepad frysning och upptining

Figur 23. Stabila analysegenskaper för det kvantitativa reaktionssystemet vid olika temperaturer under 24 timmar

Det totala RNA:t från musleverceller användes som mall för omvänd transkription med Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat # 11139ES). Det erhållna cDNA späddes 100 gånger för att amplifiera den murina mmumiR-132-genen.

3. Relaterad produktlista

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., grundat 2014, är ett högteknologiskt företag som är engagerat i FoU och produktion av verktygsenzymråmaterial och antigenantikroppar. Dess produkter inkluderar molekylära diagnostiska enzymer, proteiner och antikroppar som används i läkemedel, livsmedelssäkerhetstestning, avel, rättvisa och andra industrier. Vi har åtagit oss att förse kunder inom biovetenskap med högkvalitativa produkter och tjänster. De relaterade produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande:

Tabell 2. Relaterad produktlista