Direkt PCR är en reaktion som direkt använder blod, djur- eller växtvävnad etc. för amplifiering utan steg för nukleinsyraextraktion och nukleinsyrarening. Det ger en oöverträffad bekvämlighet för DNA-amplifiering, vilket kan spara mycket tid. Så vilka är reagenserna och produkterna som används vid direkt PCR?

1. Vad är direkt PCR
2. Vilka reagenser behövs för direkt PCR
3. Applikationsscenarier och egenskaper för Direct PCR Kit
4. Produktdata
5. Kundfeedback
6. Produktbeställningsinformation

1. Vad är direkt PCR

Efter kontinuerlig komplettering och förbättring av otaliga forskare runt om i världen har PCR-teknologin blivit den mest använda, mest använda och viktigaste grundläggande forskningsmetoden inom hela life science-området. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR, etc. utvecklade baserat på den breda tillämpningen av traditionell PCR-teknik, samt den senaste Digital PCR (Digital PCR), har avsevärt berikat forskningen hos majoriteten av vetenskapliga forskare. Dessa metoder har kraftigt påskyndat utvecklingen av modern biovetenskap, särskilt molekylärbiologi, och gjort stora bidrag till forskningen om liv och natur för hela människan. Traditionell PCR-teknik och olika nya teknologier och nya tillämpningar som härrör från den har en förutsättning, det vill säga att nukleinsyramallar med hög renhet måste erhållas i förväg. Varje biologiskt prov måste genomgå en serie av komplex och tråkig provbehandling för att få nukleinsyraprover som uppfyller de tekniska kraven för PCR. Separation och extraktion av DNA och RNA har alltid varit det grundläggande arbetet som relevant vetenskaplig och teknisk personal behöver upprepa varje dag. På grund av den enorma skillnaden mellan prover är separations- och extraktionsprocessen av DNA och RNA också mycket olika. Detta arbete kräver en hög teknisk kompetens för operatörerna. På grund av användningen av vissa mycket giftiga kemiska reagenser i den traditionella separations- och extraktionstekniken kommer långvarig exponering orsaka irreversibel skada på operatörens kropp och till och med orsaka direkt skada under experimentet. Kemiska reagenser som fenol och kloroform är viktiga cancerframkallande ämnen i laboratoriet, och det flytande kvävet som används i processen för nukleinsyraseparation och extraktion av växtvävnader utgör ett större hot mot operatörernas säkerhet under experimentet på grund av dess ultralåga temperatur. Samtidigt är det en arbetsintensiv uppgift att separera och extrahera nukleinsyror för dem som har ett stort antal prover att studera. Nukleinsyraisolerings- och extraktionssatserna på marknaden är mogna och det finns många märken, men de är alla ungefär likadana. Oavsett om det är ett centrifugalkit med kiselmembrankolonn eller ett kit med magnetiska pärlor, krävs mycket tid och kostnaden är hög. Utöver kostnaden för satsen finns det särskilda krav på laboratorieutrustning. Den automatiserade arbetsstationen som används i den magnetiska pärlmetoden är en mycket typisk storskalig högvärdig utrustning, vilket är en enorm kostnad för laboratoriet. För att sammanfatta, innan man utför PCR-experiment, är provförbehandling en oundviklig och konstant huvudvärk för forskare. Hur man löser detta problem och direkt utför PCR-experiment utan separation och extraktion av nukleinsyror har alltid varit ett problem som många vetenskapliga forskare och klinisk laboratoriepersonal har funderat på.

Direkt PCR är en reaktion där djur- eller växtvävnader direkt används för amplifiering utan nukleinsyraextraktion. På många sätt fungerar direkt PCR som konventionell PCR.Den största skillnaden är den anpassade bufferten som används i direkt PCR. Provet kan direkt utsättas för PCR-reaktion utan nukleinsyraextraktion, men det finns motsvarande krav på toleransen för enzymerna som är involverade i den direkta PCR-reaktionen och buffertens kompatibilitet. Även om det finns fler eller färre PCR-hämmare i vanliga prover, kan direkt PCR fortfarande uppnå tillförlitlig amplifiering under inverkan av enzymer och buffertar. Den traditionella PCR-reaktionen behöver dock använda nukleinsyra av hög kvalitet som mall för reaktionen. Om mallen innehåller proteiner och andra föroreningar, kommer det att hämma en mjuk utveckling av PCR-reaktionen.

Det tidigaste tillämpningsområdet för direkt PCR är området för djur och växter, såsom blod, vävnad och hår från möss, katter, höns, kaniner, får, nötkreatur och andra djur; löv och frön från växter, etc. Det används för att studera genotypning, transgen, plasmiddetektering, genknockoutanalys, identifiering av DNA-källa, artidentifiering, SNP-analys och andra områden. Dessa fält har vissa gemensamma egenskaper, det vill säga innehållet i målgenen är relativt högt och nukleinsyraextraktion är besvärlig. Därför kan direkt PCR inte bara spara tid och ha liten inverkan på resultaten, utan också spara kostnader.

2. Vilka reagenser behövs för direkt PCR

2.1 Provlysat

Provlysatet kan förberedas av dig själv eller köpas. Skillnaden i komponenterna av olika märken av lysat kommer att göra att lyseringsförmågan blir olika, och då blir lyseringstiden något annorlunda. Till exempel, för beredning av djurvävnadsprover, rekommenderas i allmänhet att lysera i 30 minuter eller över natten, och lysatet för virus sträcker sig från 3-10 minuter.

2.2 PCR-mastermix

Det rekommenderas att använda ett hot-start DNA-polymeras för att förbättra specifik amplifiering och starkare amplifieringsförmåga. Kärnan i direkt PCR är ett mycket resistent polymeras.

2.3 Ta bort eller inhibera komponenter i prover som påverkar DNA-amplifiering

Efter att provet har bearbetats av lysatet kommer proteiner, lipider och annat cellskräp att frigöras, och dessa ämnen kommer att hämma PCR-reaktionen. Därför måste direkt PCR lägga till motsvarande avlägsnande eller inhibitorer för att minska påverkan av dessa faktorer.

3. Applikationsscenarier och egenskaper för Direct PCR Kit

Direct PCR Kit från Yeasen kan direkt amplifiera proverna av växten, djurvävnaden eller blodet, och andra originalprover utan nukleinsyrarening, vilket avsevärt förenklar den experimentella PCR-processen. PCR-baserad genotypning (Figur 1) utfördes med användning av det ursprungliga provet utan genomrening (Figur 1A) eller med användning av dess lysat (Figur 1B) som en mall. Jämfört med allmän PCR-baserad genotypning har det direkta PCR-kitet mindre provförbrukning, enkel användning, låg experimentell kostnad och högkvalitativ kvantitativ provdetektion.

Figur 1. Direkt PCR-teknik.

A. Direkt metod: Ta ett litet antal prover och lägg dem direkt till PCR-blandningen för PCR-identifiering. B. Lyseringsmetod: Tillsätt provet till lyseringslösningen för att frigöra genomet och tillsätt en liten mängd av lyssupernatanten till PCR-blandningen för PCR-identifiering.

3.1 Ansökningar

Detektion av djurgenamplifiering, transgen djurgenotypning, transgen växtidentifiering, växtgenotypning, etc.

3.2 Funktioner

★   Direkt: ingen DNA-rening;
★   Snabbt: 10 min för att slutföra mallberedning, 50 min för att slutföra PCR-reaktion;
★   Enkelt: Prover kan lyseras utan klippning eller malning;
PCR Mix är i form av en mastermix, vilket minskar provtillsatsstegen
★   Spara: mindre materialförbrukning
★   Hög genomströmning: lysreaktion kan slutföras i 96-brunnars platta
★   Stark inhibitortolerans

4. Produktdata

4.1 Universaltyp för flera djur: Animal Tissue Direct PCR Kit

4.1.1 Snabbast: förkorta drifttiden

Figur 2. Ett direkt PCR-kit för djurvävnad från Yeasen skulle kunna spara mer tid.

4.1.2 Exempel: Genotypidentifiering av knockoutmöss

Figur 3. Resultaten av direkt amplifiering av direkt PCR-kit för djurvävnad för detektion av genknockout-djur.

M: 100bp DNA-stege. Banor 1-8: lysat som mall. +: 50 ng Renat genomiskt DNA som mall. ﹣: Avjoniserat vatten som mall. Flera cykler: 35 cykler. Enkelt fragment (580 bp): Knockout-djurets homozygota genom. Enkelt fragment (180 bp): Vildtypsgenom. Två fragment (580 bp/180 bp): Knockout djurets heterozygota genom.

4.2 Gnagarspecifik: Mouse Tissue Direct PCR Kit

4.2.1 Snabbare: Tillräcklig genfrisättning

Figur 4 Direkt amplifieringsresultat av direkt PCR-kit för musvävnad med olika lystider.

M: 100bp DNA-stege. +: 50 ng renat genomiskt DNA som mall. Flera cykler: 35 cykler.

4.2.2 Bättre än den allmänna alkaliska lysmetoden

Figur 5. SOX21-genamplifieringsresultat av mussvans behandlade med olika lyseringsmetoder.

M: 100 bp DNA-stege. Banor 1-2: Lysat som mall genom allmän alkalisk lysering. Banor 3-4: Lysat som en mall av direkt PCR-kit för musvävnad. +: 50 ng renat genomiskt DNA som mall. -: Avjoniserat vatten som mall. Flera cykler: 35 cykler.

4.2.3 Jämför med liknande produkter

Figur 6. SOX21-genamplifieringsresultat av mussvans behandlade med liknande produkter från olika märken.

M: 100 bp DNA-stege. +: 50 ng renat genomiskt DNA som mall. Flera cykler: 35 cykler.

4.3 Plant Tissue Direct PCR Kit

4.3.1 Provverifiering av flera typer av anläggningar

Figur 7. Resultat av direkt amplifiering av löv från olika växter.

M: 100 bp DNA-stege. C: Det renade genomiska DNA:t som mall.Banor 1-2: Bladvävnadslysatet som mall. Flera cykler: 30 cykler.

5. Kundfeedback

5.1 Möss genotypning

Figur 8. Resultaten av identifiering av musgenotyp med användning av direkt PCR-kit för musvävnad av användare från Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 Rice Direct PCR

Figur 9. Amplifiering av risrelaterade gener med användning av direkt PCR-kit för växtvävnad av användare av Huazhong Agricultural University.

6. Produktbeställningsinformation

Yeasen är ett bioteknikföretag som är engagerat i forskning, utveckling, produktion och försäljning av tre viktiga biologiska reagenser: molekyler, proteiner och celler. Produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande.

Tabell 1. Produktbeställningsinformation