Trots goda resultat under pandemin och visat stor potential har mRNA-teknologin fortfarande flera begränsningar, såsom korta uttryckstider och begränsad proteintranslation. Även om dessa funktioner kan ge en viss nivå av säkerhet, blir de begränsningar för terapier som proteinersättning. Detta kräver upprepad dosering för att upprätthålla proteinuttrycksnivåer, vilket introducerar nya risker och utmaningar såsom immunogenicitet och neutraliserande antikroppar.
Självförstärkande RNA (saRNA) kan generera samma immunsvar vid doser hundratals eller till och med tusentals gånger mindre än traditionellt mRNA. Lägre doser innebär lägre produktionskostnader och mindre frekventa injektioner kan minska potentiella toxiska biverkningar från mRNA och leveransvektorer. För närvarande har flera saRNA-kandidater gått in i kliniska prövningar världen över. Stora företag som BioNTech utvecklar aktivt saRNA-teknikpipelines.
Även om saRNA erbjuder betydande kostnads- och säkerhetsfördelar, innebär dess unika struktur nya produktionsutmaningar. saRNA-molekylen, som kombinerar sekvensen som kodar för RNA-polymeras med målproteinsekvensen, är mycket större (~10 kb) och mer komplex (innehåller fler sekundära strukturer) än traditionellt mRNA. Detta ökar avsevärt svårigheten med in vitro-transkriptionsreaktioner, vilket minskar utbytet och renheten av saRNA-produktion. Därför kräver saRNA-produktion högre standarder i syntes-, separations- och reningsprocesser.
Affinitetskromatografi, en metod som används för separation och rening, har problem som lågt målproduktutbyte och integritet. Att kombinera flera kromatografiska reningsmetoder (t.ex. tillsats av cellulosakromatografi, hydrofob omvändfaskromatografi) är besvärligt, introducerar nya föroreningar, har låga återvinningsgrader och är kostsamt. Dessutom är IVT-reaktionssystemet som används för storskalig produktion optimerat från system som är lämpliga för att syntetisera 100nt nukleinsyrasekvenser, vilket gör det olämpligt för saRNA, som överstiger 10 kb i storlek. Detta kräver optimering av befintliga IVT-reaktionssystem. För närvarande kan konventionella mRNA-reningsmetoder inte uppfylla industriella kvalitetskrav för råvätskor. Därför finns det ett akut behov av att utveckla och optimera en komplett och effektiv separations- och reningsprocess av industriell kvalitet för självförstärkande RNA.
Optimering av industriell produktion och reningsmetoder
För att utveckla ett industriellt produktionssystem för självförstärkande mRNA (saRNA) är det viktigt att först optimera buffertjontyperna och komponenterna i IVT-samtranskriptionssystemet i liten skala. Detta involverar också raffinering av den kromatografiska bufferten och provtvättningsförhållandena för nedströmsreningsprocesser. Dessa optimerade förhållanden kan sedan skalas upp till storskalig produktion för att verifiera om systemet effektivt kan öka produktionskapaciteten och förbättra kvaliteten på råprodukten.
Cotranscription Cap-Adding Reaction System
I reaktionssystemet för cotranscription cap-addition inkluderar T7-buffertkomponenterna 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT och Mg2+ salter.
T7-buffert - Magnesiumjonsalttyp
Typen av magnesiumjonsalt som används påverkar utbytet och integriteten hos mål-saRNA-produkten.
- För småskalig samtranskriptionssyntes av 1 mg mRNA, ger användning av Mg(OAc)2 som Mg2+-salt det bästa utbytet och integriteten, med värden på 100,5 µg respektive 62,9 %.
- Användning av andra magnesiumjonsalter såsom MgCl2 och MgSO4 minskar däremot utbytet med cirka 25-50 % och integriteten med cirka 10 %, vilket signifikant sänker både utbyte och integritet.
T7-buffert - Magnesiumjonkoncentration
En optimal koncentration av magnesiumacetatjoner (30-50 mM) förbättrar utbytet och integriteten hos mål-saRNA, med de bästa resultaten vid 35 mM.
- Vid en magnesiumacetatjonkoncentration på 30-50 mM når saRNA-utbytet 88,5-100,5 µg och integriteten är 58,6-62,9 %, vilket visar goda resultat.
- Vid en koncentration av 35 mM är utbytet och integriteten som högst och når 100,5 µg respektive 62,9 %.
T7 Buffer - Magnesiumjonsalt i kombination med andra salter
Tillsats av andra salter till T7-bufferten kan avsevärt förbättra utbytet och integriteten hos målprodukten.
- Bas T7-bufferten inkluderar 400 mM HEPES, 20 mM spermidin, 100 mM DTT och Mg2+ salter, vilket resulterar i ett utbyte och integritet på 100,5 µg respektive 62,9 %.
- Tillsats av ett andra salt, NaOAc, förbättrar utbytet och integriteten ytterligare: utbytet ökar med 20-110 µg, och integriteten förbättras med cirka 2-8%.
T7 Buffer - Koncentration av kombinerade salter
När den andra saltkomponenten NaOAc (Na+) har en koncentration av 5-30 mM, förbättras målsaRNA-utbytet och integriteten avsevärt, med den bästa koncentrationen vid 15 mM.
- Vid Na+-koncentrationer på 3-30 mM når saRNA-utbytet 120-210 µg, och integriteten är 64,4-70,2 %, vilket visar goda resultat.
- Vid en Na+-koncentration på 15 mM är utbytet och integriteten som högst och når 210 µg respektive 70,2 %.
Enkla reningsmetoder
Under småskalig (<50 mg) saRNA-produktion och rening kan användning av olika reningsmetoder avsevärt minska dsRNA-innehållet och proteinrester, vilket säkerställer högt utbyte, täckningseffektivitet och produktintegritet. Effektiviteten av reningsmetoderna från bäst till sämst är: affinitetskromatografi > litiumkloridfällning > ultrafiltrering, cellulosakromatografi.
-
Affinitetskromatografi
För storskalig mRNA-produktion är kromatografi att föredra. Alternativen inkluderar omvänd fas, jonbyte, hydrofob och affinitetskromatografi, var och en med sina för- och nackdelar. Affinitetskromatografi, som ofta används för att fånga poly(A)-mRNA, erbjuder skalbarhet och plattformslösningar med >90 % återvinningsgrad.
mRNA:s viktigaste strukturella egenskaper, 5'-kåpan och 3'-poly(A)-svansen, underlättar rening. Affinitetskromatografi, liknande magnetisk pärlorrening, använder dT-kopplade pärlor för att fånga poly(A)-svans-mRNA. Höga saltförhållanden skyddar negativa laddningar, vilket möjliggör bindning genom AT-vätebindningar, och mRNA elueras under milt neutralt pH och låg konduktivitet.
Affinitetskromatografi för RNA involverar "hög saltbindning, eluering med låg salthalt". Buffertsammansättning, molekylstorlek, temperatur och provkoncentration påverkar processen avsevärt. Att välja den optimala salttypen och koncentrationen genom experiment är avgörande för effektiv rening.
Rening: Denna metod ger den högsta produktintegriteten (80,3 %), den lägsta dsRNA-halten (0,01 µg/mg), den högsta täckningseffektiviteten (96,4 %) och de minsta proteinresterna (1,20 µg/mg), med ett utbyte på 136 µg och en återvinningsgrad på 65 % av produktens renhet och kvalitet.
-
Andra reningsmetoder:
Litiumkloridutfällning
Principen för att rena mRNA med LiCl är att litium kan minska elektrostatisk repulsion mellan molekyler vid ett visst pH, vilket möjliggör effektiv RNA-fällning.Fällningen separeras sedan genom centrifugering, löses för att erhålla ett rent RNA-prov. LiCl-fällning är enkel, snabb, effektiv för mRNA av olika storlekar och ger produkter med hög renhet. Emellertid kan kvarvarande litiumjoner hämma mRNA. Det rekommenderas att använda LiCl-fällning för lösningar som innehåller minst 400 µg/ml RNA för att säkerställa reningseffektivitet. Denna metod ger ett högt utbyte (210 µg), men produktens integritet är endast 70,2 %, vilket avsevärt minskar produktkvaliteten. Den är inte lämplig för storskalig produktion.
Magnetisk pärla metod:
Magnetiska pärlor är små partiklar som rör sig i riktning under ett magnetfält, vanligtvis sammansatt av en järnoxidkärna och en yttre beläggning. Magnetisk pärlorrening är en vanlig molekylärbiologisk teknik för att snabbt och effektivt berika mRNA-molekyler från blandningar. Olika funktionella magnetiska pärlor har olika ytfunktionella grupper (t.ex. hydroxyl, karboxyl, Oligo(dT), streptavidin) för rening av olika biomolekyler.
Karboxylerade magnetiska pärlor kan effektivt rena nukleinsyror, med mRNA-molekyler som binder genom elektrostatiska interaktioner under sura förhållanden. Justering av betingelser möjliggör selektiv bindning och frisättning av mRNA. Längre mRNA med mer exponerade negativt laddade fosfatgrupper binder lättare till pärlorna. För kortare mRNA kan större pärlvolymer behövas. Oligo(dT)-kopplade magnetiska pärlor, liknande affinitetskromatografi, använder specifik bindning mellan poly(A)-svansen av mRNA och pärlornas Oligo(dT).
Ultrafiltrering
Denna metod resulterar i den lägsta saRNA-integriteten, cirka 8 % lägre än affinitetskromatografi, med den högsta proteinresten (4,58 µg/mg).
Cellulosakromatografi
Denna metod uppnår lågt dsRNA-innehåll (0,009 µg/mg) och en hög takhastighet (96,4%). Proteinrester är dock något högre (5,30 µg/mg), med en återvinningsgrad på endast 57 % och ett utbyte på 120 µg, vilka båda är signifikant lägre än de som uppnås med affinitetskromatografi (med cirka 10 % respektive 16 µg).
Reningsprocess
Kromatografiska buffertkomponenter - Tillsats av reduktionsmedel
Att tillsätta reduktionsmedel till den kromatografiska bufferten under rening kan avsevärt förbättra produktens integritet, återvinningshastighet och täckningseffektivitet, samtidigt som nivåerna av biprodukt dsRNA och proteinrester minskar jämfört med att inte tillsätta reduktionsmedel.
- Utan reduktionsmedel:
- Utbyte: 136 µg
- Återhämtning: 65 %
- Integritet: 80,3 %
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 1,20 µg/mg
– Produktens renhet och kvalitet är bra.
- Med reduktionsmedel (TCPE, DTT, β-merkaptoetanol):
- Utbytet ökar med 10-40µg
- Återvinningsgraden ökar med 5-18 %
- Integriteten förbättras med cirka 1-5 %
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- dsRNA: så lågt som 0,005 µg/mg
- Proteinrester: så lågt som 0,20 µg/mg
- Betydande förbättring av produktens renhet och kvalitet.
Kromatografiska buffertkomponenter - typer av reduktionsmedel
Olika typer av reduktionsmedel som tillsätts till den kromatografiska bufferten kan ytterligare förbättra produktens integritet, återhämtningshastighet och täckningseffektivitet, samtidigt som dsRNA och proteinrester reduceras. TCPE har visat sig vara det mest effektiva reduktionsmedlet.
- Med TCPE:
- Utbyte: 175 µg
- Återhämtning: 83 %
- Integritet: 85,2 %
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 0,20 µg/mg
- Utmärkt produktrenhet och kvalitet.
Kromatografiska buffertkomponenter - Koncentration av reduktionsmedel
Tillsats av reduktionsmedel i en koncentration av 5-15 mM i den kromatografiska bufferten kan avsevärt förbättra produktens integritet, återhämtningshastighet och täckningseffektivitet, samtidigt som dsRNA och proteinrester reduceras. Den optimala koncentrationen är 10mM.
- Lägga till 5-15 mM TCPE:
- Utbyte: 160-178 µg
- Återvinningsgrad: 76-85 %
- Integritet: cirka 85 %
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 0,20-0,52 µg/mg
- Bra produktrenhet och kvalitet.
- Med 10mM TCPE:
- Utbyte: 178 µg
- Återhämtning: 85 %
- Integritet: 85,4 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 0,20 µg/mg
- Optimal produktrenhet och kvalitet.
Tvättförhållande
Att kontrollera förhållandet mellan kromatografisk buffert och injektionsvatten i tvättprocessen (10-25):(75-90) kan avsevärt förbättra produktens integritet, återvinningshastighet och täckningseffektivitet, samtidigt som dsRNA och proteinrester minskar. Det optimala förhållandet är 15:85.
- Förhållande (10-25):(75-90):
- Utbyte: 150-179 µg
- Återvinningsgrad: 71-85 %
- Integritet: 84-90 %
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: cirka 0,20 µg/mg
- Bra produktrenhet och kvalitet.
- Med förhållande 15:85:
- Utbyte: 179 µg
- Återhämtning: 85 %
- Integritet: 90,0 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 0,20 µg/mg
- Optimal produktrenhet och kvalitet.
Kombinerade reningsmetoder
Att använda en kombination av olika reningsmetoder kan ytterligare minska nivåerna av dsRNA och proteinrester i produkten, vilket förbättrar den övergripande kvaliteten. Den föredragna ordningen för reningsmetoder är: affinitetskromatografi > ultrafiltrering + affinitetskromatografi > affinitetskromatografi + cellulosakromatografi > cellulosakromatografi + ultrafiltrering. Enbart affinitetskromatografi ger de bästa resultaten.
-
Ensam affinitetskromatografi:
- Utbyte: 179 µg
- Återhämtning: 85 %
- Integritet: 90,0 %
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Kapningseffektivitet: 96,4 %
- Proteinrester: 0,20 µg/mg
- Högsta produktrenhet och kvalitet.
-
Ultrafiltrering + affinitetskromatografi:
- Utbyte: 170 µg (9 µg mindre än enbart affinitetskromatografi)
- Återvinningsgrad: 81 % (4 % mindre än enbart affinitetskromatografi)
- Integritet: 88,5 %
- dsRNA: 0,0015 µg/mg
- Proteinrester: 0,18 µg/mg
- Lätt minskning av dsRNA och proteinrester jämfört med enbart affinitetskromatografi, men signifikant minskning av utbyte och återhämtningshastighet. Denna metod är mer komplex, fördubblar reningstiden och ökar kostnaderna.
-
Affinitetskromatografi + cellulosakromatografi / cellulosakromatografi + ultrafiltrering:
- dsRNA: 0,005 µg/mg lägre än enstaka metoder
- Utbyte: 60-100 µg mindre
- Återvinningsgrad: 30-40% lägre
– Ökade steg ger högre arbets- och materialkostnader.
Storskalig produktion
Vid storskalig produktion, med användning av affinitetskromatografi, affinitetskromatografi kombinerat med cellulosakromatografi, eller ultrafiltrering kombinerat med affinitetskromatografi, ökar utbytet av självförstärkande mRNA signifikant till 140-185 µg, med en återhämtningshastighet på 67-88%. Produktintegriteten är 93-94%, dsRNA-innehållet kontrolleras inom 0,0018-0,0020 µg/mg, täckningseffektiviteten når 96,1-96,4% och proteinrester hålls inom 0,04-0,05 µg/mg. Detta visar på god skalbarhet och effektivitet för storskalig produktion.
Hänvisning:
[8] Industriell produktion och separation Reningsmetoder för självförstärkande mRNA råvätska och dess tillämpningar [P]. Patent: CN118048418A. 2024.05.17.
Beställningsinformation
Yeasen utvecklade ett nytt CleaScrip™ T7 RNA-polymeras som är ett förstklassigt enzym för mRNA-syntes, för att cellulosabehandlingen inte längre behövs för dsRNA-borttagning, vilket sparar både tid och arbetskostnader. DsRNA-innehållet i mRNA producerat av CleaScript™ T7 RNA-polymeras är lägre än det i mRNA som produceras av Wild Type T7 RNA-polymeras, både före och efter dsRNA-borttagningssteget med cellulosabehandling. Kolla in fler detaljer från följande länkar: