Cap-strukturen är en viktig komponent i utvecklingen av mRNA-vacciner och läkemedel. Syntetisk mRNA-teknologi förlitar sig på Cap1 för att förbättra stabiliteten, translationseffektiviteten och minska den medfödda immunigenkänningen av mRNA av tullliknande receptorer (TLR) och andra immunsensorer, vilket minimerar oönskad immunaktivering. Detta förhindrar oönskade inflammatoriska svar och förbättrar därigenom stabiliteten och effektiviteten hos det terapeutiska mRNA:t i mänskliga celler.
Tidig upptäckt och Cap0-struktur
I mitten av 1970-talet upptäckte forskning om eukaryot mRNA en 5'-terminalstruktur som nu är känd som Cap0, där en N7-metylguanosinkapsel (m7G) är fäst vid den första nukleotiden i 5'-änden. Denna modifiering visade sig skydda mRNA från nedbrytning av exonukleaser, hjälpa till vid kärnexport och främja ribosomigenkänning för translationsinitiering. Cap0 var den första karakteriserade lockstrukturen, med dess metylering begränsad till själva guanosinkapseln. Upptäckten av denna 5'-kapsel och dess funktioner markerade ett betydande genombrott för att förstå eukaryota mRNA-kapslar och deras roll i mRNA-modifieringar.
Uppkomsten av Cap1
Cap1-strukturen, en kritisk egenskap hos eukaryot mRNA, spelar en avgörande roll i mRNA-stabilitet, translation och immunigenkänning. mRNA-kapselstrukturen, bestående av en N7-metylguanosin (m7G) kopplad till den första nukleotiden via en 5'-5' trifosfatkoppling, utvecklades från tidiga studier på eukaryot mRNA post-transkriptionella modifieringar på 1970-talet.
Struktur av 5'-änd-kapslade mRNA.【1】 Ytterligare undersökningar avslöjade att i de flesta eukaryota mRNA, är den första nukleotiden efter locket (position +1) också metylerad vid 2'-O-positionen av ribosen, en process som kallas 2'-O-metylering. Denna upptäckt, känd som Cap1-strukturen (m7GpppNm), lade ytterligare ett lager av funktionell betydelse till mRNA-modifieringar. Cap1-modifieringen visade sig finjustera mRNA-stabilitet och förhindra immunigenkänning av det medfödda immunsystemet, särskilt i däggdjursceller, där den hjälper till att undvika igenkänning av mönsterigenkänningsreceptorer som RIG-I, TLRs och MDA5【2】. Detta var avgörande för både mRNA-metabolism och utvecklingen av mRNA-baserade teknologier, inklusive mRNA-vaccination och genterapiapplikationer.
Tekniska utmaningar inom mRNA-industrin och nuvarande lösningar
Flera tekniska utmaningar kvarstår i den utbredda tillämpningen och optimeringen av mRNA-vacciner, inklusive problem med högdos mRNA, immunsvar, stabilitet och leverans. En betydande utmaning i mRNA-industrin är behovet av höga doser av mRNA för att framkalla ett robust immunsvar. Detta beror på flera faktorer:
Snabb nedbrytning: mRNA är i sig instabilt och mottagligt för nedbrytning genom avkapsling av enzymer och ribonukleaser (RNaser) som finns i biologiska system.
Begränsad översättningseffektivitet: Effektiviteten med vilken mRNA översätts till protein kan variera, vilket kräver högre mängder mRNA för att generera tillräckliga antigennivåer för ett immunsvar. Översättningseffektiviteten är relaterad till affiniteten för Cap1 och translationsinitieringsfaktorn eIF4E.
Bildandet av det grundläggande översättningsinitieringskomplexet i eukaryoter.【3】
Immunogenicitet och oönskade immunreaktioner: Det tredje största hindret är det medfödda immunsvaret som kan utlösas av själva mRNA:t, speciellt för dsRNA eller ofullständigt mRNA. Även om en viss nivå av immunaktivering önskas för att stimulera det adaptiva immunsystemet, kan överdriven aktivering leda till inflammatoriska svar, vilket kan minska vaccinets effektivitet eller orsaka biverkningar.
Capture Technology History
-
Enzymatisk kapslingsteknik: Enzymatisk kapning, som introducerades i de tidiga dagarna av mRNA-forskning, innebär att man använder lockande enzymer som guanylyltransferas och metyltransferas för att lägga till ett naturligt 5'-lock post-transkriptionellt. Denna metod säkerställer hög trohet och täckningseffektivitet vid mRNA-translation, särskilt för terapeutiska tillämpningar.
-
Syntetiska lockanaloger (1980-2000-tal): Forskare utvecklade syntetiska cap-analoger för in vitro-syntes av capped mRNA, som hjälper till att studera mRNA-funktion och genuttryck. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) är en syntetisk cap-analog designad för att förhindra felaktig inkorporering av caps under mRNA-syntes, vilket förbättrar translationseffektiviteten för mRNA för vacciner och genterapier. Emellertid är kapslingseffektiviteten och utbytet av ARCA-täckning låg.
-
Cap1 Technology (2010-talet): Cap1 co-transcriptional capping-metod som förenklar processen genom att inkorporera locket direkt under mRNA-syntes. Denna metod förbättrar effektiviteten och ger en hög procentandel av korrekt täckt mRNA, vilket gör den idealisk för storskaliga terapeutiska tillämpningar som mRNA-vacciner.
För närvarande har enzymatisk kapslingsteknik varit avgörande i utvecklingen av mRNA-baserade terapier, inklusive COVID-19-vacciner, vilket säkerställer stabilitet och effektiv översättning av terapeutiskt mRNA.
Jämförelse av Enzymatisk täckning, nästa generation LZCap Capping och första generationens Capping (ARCA) metod
Utveckla nästa generations cap-analoger
Vi siktade på att utveckla cap-analoger med resistens mot decapping-enzymer, hög affinitet till eIF4E för att förbättra translationseffektiviteten och lägre immunogenicitet. Dessa framsteg är avgörande för att förbättra effektiviteten av mRNA-baserade terapier, inklusive anti-cancerbehandlingar och genterapiapplikationer.
Designar LZCap
När vi designade LZCap fokuserade vi främst på att skapa en cap-analog med hög affinitet till eIF4E. Enzymer har en relativt "specifik" igenkänning av substrat. När vi utformar en ny kepsstruktur strävar vi därför efter att bibehålla likheten med naturliga/kända strukturer så mycket som möjligt. Den naturliga strukturen har en ribos 3' OH, som kan modifieras (t.ex. metylering). Baserat på detta övervägande valde vi att lägga till ett kol i 3'-positionen för nyhet, följt av en NH för att efterlikna vätebindningen av OH, och sedan en acetylgrupp för att minska basiciteten av NH och förbättra dess vätebindningsförmåga. Aktiviteten hos LZCap är bättre än metylerad naturlig cap, möjligen på grund av ökad vätebindning. Jämfört med metyl- och metoxigrupperna kan acetylaminogruppen också öka van der Waals-interaktioner mellan substratet (cap) och den initierande faktorn (enzym).
Acetylaminogruppens stabilitet
Acetylaminogruppen är redan tillräckligt stabil. Den är mycket mer stabil än den 7-metylerade positionen och fosfodiesterbindningen, som är de minst stabila delarna av locket.
Utbyte och täckning LZCaps effektivitet
Med LZCap AG(3'Acm) cap är luciferas-mRNA-kapslingseffektiviteten cirka 97,59 %, och upp till 200 μg capped mRNA kan erhållas med 1 μg DNA-mall i en standard in vitro-transkriptionsreaktion (IVT) med T7 RNA-polymeras. mRNA-renheten är upp till 99 % efter enkel LiCl-utfällning. Denna höga täckningseffektivitet och avkastning gör LZCap till ett attraktivt alternativ för olika applikationer, inklusive proteinproduktion och genterapi.
Cap-strukturen är en viktig komponent i utvecklingen av mRNA-vacciner och läkemedel.Syntetisk mRNA-teknologi förlitar sig på Cap1 för att förbättra stabiliteten, translationseffektiviteten och minskar den medfödda immunigenkänningen av mRNA av tullliknande receptorer (TLR) och andra immunsensorer, vilket minimerar oönskad immunaktivering. Detta förhindrar oönskade inflammatoriska svar och förbättrar därigenom stabiliteten och effektiviteten hos det terapeutiska mRNA:t i mänskliga celler.
| Produkt | Lock AG (3'-OMe-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (inget tak) |
| mRNA-utbyte (μg) | 164 | 173 | 200 |
MS-analys av kapslingseffektiviteten för LZCapped Luciferase-mRNA med RNAse H-baserad metod. Beläggningseffektiviteten är cirka 97,59 %,
Hur är mRNA-stabiliteten mot det decapping-enzymet
mRNA med LZCap AG(3'Acm) och LZCap AG M6 (3'Acm) visar högre motståndskraft mot decapping-enzymet (NEB). Det noteras att CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) också är resistent mot decapping enzym, men den vanliga Cap AG (3'-OMe-7mG) visar inte motståndet.
Hur är bindningsaffiniteten för LZCap till eIF4E?
Vad sägs om proteinuttrycket av LZCap AG(3'Acm) capped mRNA?
Uttrycket av LZCap AG(3'Acm) capped luciferas-mRNA är signifikant högre än det för Cap1-analogen (3'-OMe-7mG) capped mRNA i olika cellinjer* (3T3-L1，Hela，JAWs， HEK293T och Huh7)，Experimentet med 130 gånger högre LC-upprepning. AG(3'Acm) capped luciferas-mRNA än (3'-OMe-7mG) capped mRNA i genomsnitt. Liknande resultat observeras hos möss. Proteinuttrycksnivån kan variera något med olika mRNA-sekvenser.
Har du fler djurdata?
Expressionseffektiviteten för LZCap AG(3'Acm) eller LZCap AG(3'FMom)
GLuc-kodande mRNA visar ett högre uttryck in vivo i förhållande till CapAG (3'-OMe-7mG) capped mRNA i Cynomolgus Monkey and Pig.
Vad sägs om den medfödda immunogeniciteten hos LZCap AG-kapslade mRNA?
LZCapAG (3'Acm) capped mRNA visar låg medfödd immunogenicitet. TLR8, TLR7, IL-1A och B spelar en viktig roll i immunsvaret som induceras av oskyddat RNA. In vivo-studierna av LZCapped mRNA-immunogenicitetsanalys visade att uncapped RNA orsakade signifikanta förändringar i transkriptionsnivån av immunrelaterade faktorer hos möss. Både LZCap och 3'-OMe-7mG capped mRNA visar liknande lägre immunfaktor transkriptionsnivå i möss efter en enda RNA-stimulerad injektion.
Gjorde du något säkerhetstest?
Ja, vi gjorde Cytotoxicitetstest, Human Polymerase Inhibition Study och Ames Test.
- Det finns ingen eller liten cytotoxicitet observerad för nukleosidmonomeren av 3'-Acm-7mG (CC50＞10000nM) i 293T, Huh7, MRC5, THP1 och U87MG celler.
- Humant DNA-polymeras (α,β, γ och Klenow) och mitokondriellt RNA-polymeras (hPOLRMT) aktivitetsinhiberingsstudier visar att 3'-Acm-7mG TP inte hämmar humant DNA eller RNA-polymeras.
- Det bakteriella omvända mutationstestet (Ames) upptäcker associerade genetiska förändringar, såväl som genotoxiska cancerframkallande ämnen hos de flesta gnagare och människor. Ames-test visade att 3'-Acm-7mG inte har någon genotoxicitet.
Har denna produkt patenterats?
Ja. Patentet har beviljats i USA.
Beställningsinformation
| Produktnamn | Specifikationer | Katalog nr. |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)( 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 mM） | 100 μL, 1 mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Förfrågan |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | Förfrågan |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100 μL, 1 mL | Förfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 mL | jagförfrågan |
Hänvisning:
- Molekylära mekanismer för RNA-kapsling och metylering av coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA-vacciner — en ny era inom vaccinologi. Nat. Rev. Drug. Discov. 17, 261–279 (2018).
- Translationsinitiering reglerad av RNA-bindande protein i däggdjur: Moduleringen av translationsinitieringskomplex av transverkande faktorer, celler 2021, 10(7), 1711