T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimerar transkriptionsreaktionssystemet. Kitet kan syntetisera det enkelsträngade RNA:t effektivt genom att använda T7 RNA-polymeras, det linjära dubbelsträngade DNA:t med T7-promotorsekvensen som mall och NTP:er som substrat för att kontrollera DNA-sekvensen nedströms om promotorn. Under transkription kan modifierade nukleotider läggas till substratet för att framställa biotin eller färgämnesmärkt RNA.

1. Introduktion av T7 High Yield RNA Synthesis Kit
2. Principer för in vitro transkription
3. Fördelar med Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit
4. Produktens prestanda
5. Hur man använder detta kit
6. Vanliga frågor
7. Beställningsinformation

1. Introduktion av T7 High Yield RNA Synthesis Kit

T7 High Yield RNA Synthesis Kit kan syntetisera både långa transkript och korta transkript, och RNA kan produceras 100-200 μg med 1 μg DNA-mallinmatning. Det syntetiserade RNA:t kan användas för olika nedströmsapplikationer, såsom RNA-struktur- och funktionsforskning, RNas-skydd, sondhybridisering, RNA-interferens, mikroinjektion och in vitro översättning.

2. Principer för in vitro transkription

Bild 1. In vitro transkriptionsprocess

3. Fördelar med Yeasen T7 High Yield RNA Synthesis Kit

Extremt höga skördar - upp till 200 µg på 2 timmar
Mångsidig – lämplig för 20nt-10000nt RNA-transkript
Flera användningsområden – genererar omärkt, märkt eller täckt RNA

4. Produktens prestanda

Figur 2. IVT avkastningsjämförelse

Obs: Alla reaktionsreagenser kommer från T7 RNA Synthesis Kit (Yeasen#10623 eller B*-företag). IVT-reaktionsutbytena för Yeasen och B*-företaget visas ovan.

Figur 3. Kvaliteten på transkriptionsprodukter för olika längder

Figur 4. Expressionsnivån för det transkriberade mRNA:t i HEK-293-celler

Obs: mRNA:t är täckt med vaccinia-capping-enzym (Yeasen#10614/10615)

5. Hur man använder detta kit

5.1 Reagens för upptining

Centrifugera T7 RNA-polymerasblandningen kort och lägg på is. Tina 10× transkriptionsbuffert och ribonukleotider (ATP, CTP, GTP, UTP), blanda och centrifugera till botten av röret, placera 10× transkriptionsbuffert vid rumstemperatur och placera fyra typer av ribonukleotider på is.

5.2 Förbered transkriptionsreaktionssystemet enligt följande tabell

Tabell 1.Framställningsmetod för transkriptionsreaktionssystemet

Notera:
a) Reaktionen framställs vid rumstemperatur. Eftersom 10× transkriptionsbufferten innehåller spermidin, kommer koncentrationen av spermidin för hög vid låga temperaturer att orsaka DNA-mallfällning.
b) Kort transkript (<100 nt), 2 µg mall kan användas, transkriptionstiden ökas till 4-8 timmar.
c) För långa transkript (>1000 nt) rekommenderas de linjäriserade plasmidmallarna för transkription.
d) Utför reaktionen i PCR-maskinen med det varma locket öppet för att förhindra att reaktionslösningen avdunstar under lång tid.
e) Reaktionsprodukten kan ha en vit fällning. Detta är magnesiumpyrofosfat som bildas av fritt pyrofosfat och magnesiumjoner under reaktionen, vilket inte kommer att påverka de efterföljande experimenten. Du kan lägga till EDTA för att ta bort den. Om du är angående tillsats av EDTA påverkar efterföljande experiment, kan supernatanten också återvinnas genom centrifugering.
f) Reagenserna och behållarna bör vara utan RNas-kontamination.

5.3 Inkubera vid 37°C i 2 timmar

Blanda ovanstående reaktionslösning, centrifugera kort till botten av röret och inkubera vid 37°C i 2 timmar. Om transkriptionslängden är mindre än 100 nt, öka reaktionstiden till 4-8 timmar.

5.4 DNas I-behandling (valfritt)

När reaktionen är klar, tillsätt 2 μL DNas I (RNase-fri) till varje rör och inkubera vid 37 °C i 15 minuter för att ta bort mall-DNA:et.

6. Vanliga frågor

6.1 Utbytet av IVT-reaktionen är lågt

Mallens kvalitet är nära relaterad till avkastningen. Om utbytet av den experimentella gruppen är betydligt lägre än den för den positiva kontrollgruppen, kan de möjliga orsakerna vara.
① Mallarna innehåller komponenter som kommer att hämma IVT-reaktion.
② Det är något fel med mallar.

6.2 Förslag

① Rengör mallen igen.
② Bekräfta mallarnas koncentration och integritet.
③ Förläng reaktionstiden.
④ Öka mallens inmatning.
⑤ Prova andra RNA-polymeraser och motsvarande promotorer.

6.3 Utbytet av korta avskrifter är lågt

Om måltranskripten är kortare än 100 nt, förläng reaktionstiden till 4-8 timmar eller öka inmatningen av mallar till 2ug i ett 20 μL reaktionssystem.

6.4 Det finns oväntade längre utskrifter

Om resultatet av gelelektrofores visar att det finns oväntade längre transkript, kan de möjliga orsakerna vara:
① Plasmidmallar kanske inte är helt linjäriserade.
②Mallar har sammanhängande ändar med 3' överhäng.
③Transkriptioner har en sekundär struktur som inte är helt denaturerad.

6.5 Förslag

①Kontrollera om plasmidmallarna är helt linjäriserade. Vid behov, utför plasmidlinearisering igen.
②Välj lämpliga restriktionsenzymer för att linjärisera plasmidmallar och undvik att producera kohesiva ändar med 3'-överhäng. Det är praktiskt möjligt att använda Klenow-fragment eller T4-DNA-polymeras för att producera en trubbig ände vid behov.
③Använd denaturerad gel för att upptäcka transkript.

6.6 Det finns oväntade kortare utskrifter

Om resultatet av gelelektrofores visar att det finns oväntade kortare transkript, kan de möjliga orsakerna vara:
①Det finns en sekvens som är analog med termineringssekvensen för T7 RNA-polymeras i mallar.
②GC-innehållet i mallar är högt.

6.7 Förslag

① Minska reaktionstemperaturen (som 30 ℃) men observera att sänkning av reaktionstemperaturen ibland kommer att minska utbyten.
②Prova andra RNA-polymeraser för att katalysera IVT-reaktionen.
③Om GC-innehållet i mallarna är högt, ställ in IVT-reaktionstemperaturen på 42 ℃ eller lägg till SSB i IVT-reaktionssystemet för att öka utbytet och längden på transkript.

6.8 Det förekommer utsmetande av transkript under gelelektrofores

Om det förekommer utsmetande av transkript under gelelektrofores kan de möjliga orsakerna vara:
①Det finns RNase-kontamination under experimentell drift.
②DNA-mallar är kontaminerade av RNaser.

6.9 Förslag

①Se till att alla reagenser är formulerade med RNas-fritt H2O. Använd RNase-fria pipettspetsar och Eppendorf-rör och använd latexhandskar och engångsmasker under experimentell drift.
②Rerena DNA-mallar igen.

7. Beställningsinformation

Följande är representativa produkter som erbjuds av Yeasen. Ytterligare storlekar finns tillgängliga. Våra produkter är mycket optimerade för att fungera tillsammans, för att säkerställa överlägsen prestanda och reproducerbarhet.
Vi kan även erbjuda skräddarsydda tjänster. Om du är intresserad av en produkt som inte visas, kontakta oss så hjälper vi dig att möta dina behov.

Tabell 2.Produktinformation

Angående läsning:

GMP-grade reagens för mRNA in vitro syntes

Yeasen Biotechnology GMP Grade mRNA In Vitro Synthesis Raw Materials