Genombrottsprestation från Yeasen och Molefuture bioteknik

Med den snabba utvecklingen av bioteknik har mRNA-terapi, som en framväxande behandlingsmetod, väckt stor uppmärksamhet på grund av dess starka programmerbarhet och snabba svarshastighet. Inom områden som mRNA-vaccin och genterapi är effektiv syntes av högkvalitativt mRNA ett avgörande steg för att uppnå terapeutiska mål. I denna process spelar T7 RNA-polymeras en avgörande roll, eftersom det effektivt kan katalysera in vitro-syntesen av mRNA.

Problemet med dsRNA-biprodukten av T7 RNA-polymeras

Även om T7 RNA-polymeras spelar en viktig roll i mRNA-syntes, resulterar den faktiska operationen ofta i produktionen av dubbelsträngat RNA (dsRNA) som en biprodukt. Närvaron av dsRNA minskar inte bara utbytet och renheten av mRNA utan kan också utlösa ospecifika immunsvar, vilket påverkar effektivitet och säkerhet. Därför har minskad produktion av dsRNA blivit ett akut behov i branschen. För närvarande inkluderar metoder för att reducera dsRNA främst optimering av reaktionsförhållanden och användning av hjälpenzymer. Även om dessa metoder kan minska produktionen av dsRNA i viss mån, kommer de ofta med problem som komplex drift och ökade kostnader.

Varför ska vi göra T7 RNA-polymerasteknik?

Att direkt modifiera T7 RNA-polymeras för att minska dsRNA-produktionen är en mer grundläggande lösning. Enzymstyrda evolutionstekniker kan förbättra dess katalytiska egenskaper och öka renheten och utbytet av produkter genom att exakt ändra enzymets aminosyrasekvens eller struktur. För T7 RNA-polymeras kan riktad modifiering inte bara minska dsRNA-produktionen utan också förbättra den övergripande effektiviteten och kvaliteten på mRNA-syntes.

Som leverantör av mRNA in vitro-syntesråvaror, Yeasen Bioteknik och dess dotterbolag Molefuture Bioteknik, ha utvecklat ett nytt T7 RNA-polymeras – med hjälp av ZymeEditor-riktad evolution-plattform. För att minimera produktionen av biprodukter som dsRNA under in vitro-transkriptionsprocesser har evolutionsteamet konstruerat T7 RNA-polymeras genom en kombination av rationell design och riktad screening.

Hur genereras dsRNA?

Enligt litteraturrapporter härrör produktionen av biprodukten dsRNA huvudsakligen från två källor (Figur 1): Den första är under övergången av T7 RNA-polymeras från initieringskonformationen till förlängningskonformationen i de tidiga stadierna av transkription, det ternära transkriptionskomplexet är benäget att dissocieras [1], vilket resulterar i frisättning av ett stort antal RNA med långa RNA (ett stort antal RNA) 20 nt in i systemet. Dessa RNA-kedjor fungerar som "primers", komplementär parning med långa RNA-kedjor, och sträcker sig för att producera dsRNA under verkan av T7 RNA-polymeras RNA-beroende RNA-polymerasaktivitet (RDRP-aktivitet) [2,3]. Den andra källan utlöses av den terminala ribonukleotidöverföringsaktiviteten som innehas av T7 RNA-polymeras. När transkriptionsreaktionen når den linjära mallens ände kan T7 RNA-polymeras slumpmässigt lägga till flera ribonukleotider utan mallberoende. Dessa ribonukleotider, som bildar "slumpmässiga primrar", kan omvänd-veckas och komplementärt paras ihop med mål-mRNA-regionen och sträcker sig för att producera dsRNA. Det dsRNA som produceras genom looping kallas loopback-dsRNA [3,4]. Därför, för att minska dsRNA-biprodukter, ligger fokus för T7 RNA-polymerasmodifiering i att stabilisera det tidiga transkriptions-ternära komplexet eller försvaga den terminala överföringsaktiviteten och RNA-beroende RNA-polymeras (RDRP) aktiviteten hos T7 RNA-polymeras.

Figur 1. Schematiskt diagram av energibarriären och dsRNA-bildningsprincipen (opublicerad data)

Hur man övervinner energibarriär av T7 RNA-polymeras konformationell övergång?

Genom strukturell och fri energianalys upptäckte teamet å ena sidan att tillsammans med konformationsförändringarna av T7 RNA-polymeras, finns det också en förändring i energi. Den fria energin för förlängningskonformationen är signifikant högre än den för initieringskonformationen, vilket indikerar att transkriptionsprocessen behöver övervinna en högre energibarriär för att producera kompletta mRNA-kedjor. En hög energibarriär är ogynnsam för smidig konformationsövergång. Därför utnyttjade laget rationell screeningmetoder för att identifiera över 20 hotspot-aminosyror och konstruerade motsvarande mättnadsmutagenesbibliotek.

Hur man ändrar terminal överföring och RDRP-aktiviteter av T7 RNA-polymeras

Å andra sidan, med tanke på de begränsade rapporterna om funktionerna, ställena och strukturella domänerna relaterade till terminal överföring och RDRP-aktiviteter av T7 RNA-polymeras, och eftersom dessa två aktiviteter, som är funktionellt lika, sannolikt delar nyckelställen med huvudreaktionen av T7 RNA-polymeras - transkriptionsaktivitet (dvs DNA-beroende RNA-polymerisationsaktivitet, DDRP) - är det svårt att hitta direkta aminosyror för hotspot-aktivitet för modifieringsställen. Därför konstruerade teamet samtidigt flera slumpmässiga mutationsbibliotek baserade på felbenägen PCR, kombinerat med högkapacitetsutvecklingskapaciteten hos ZymeEditor-plattformen, vilket resulterade i en mångfald som översteg 10^6 för varje enskilt bibliotek.

Sondbaserad upptäckt av ideal T7 RNA-polymeras

För att balansera produktionen av T7 RNA-polymeras och övervaka innehållet av dsRNA i in vitro-transkriptionsreaktionen, designade teamet, med hänvisning till optimerade transkriptionsmallar, noggrant flera fluorescerande sönder riktade mot olika regioner av mål-mRNA-produkterna. Dessa prober associerar information såsom reaktionsutbyte, integritet och dsRNA-innehåll i systemet med fluorescenssignaler. Ju starkare systemets fluorescensintensitet är, desto fördelaktigare prestanda för mutanten. I teorin kan denna screeningsmetod rangordna mutanter baserat på fluorescensintensiteten hos olika prober, erhålla T7 RNA-polymerasmutanter med högt utbyte eller reducerat Abort-RNA, såväl som mutanter med förbättrad integritet eller reducerad loopback-dsRNA. När reaktionsmallen ersätts med RNA kan mutanter med reducerad RDRP-aktivitet också screenas negativt, vilket förbättrar mallselektiviteten för T7 RNA-polymeras. Dessutom, genom att lägga till modifierade nukleotider, cap-analoger och öka reaktionstemperaturen i droppreaktionssystemet, kan ytterligare screening utföras för att välja T7 RNA-polymerasmutanter som tolererar icke-naturliga substrat och uppvisar förbättrad termisk stabilitet.

Hur man skärmar bäst T7 RNA-polymeras?

Baserat på storleken på biblioteken, teamet utvecklat screeningprocesser med ultrahög genomströmning baserade på fluorescensaktiverad droppsortering (FADS) och screeningsprocesser med hög genomströmning baserade på traditionella mikroplattmetoder (MTPS).Genom flera omgångar av experiment screenades över 10^7 mutanter totalt, vilket resulterade i flera mutanter med signifikant reducerat dsRNA-innehåll. Bland dem visade vissa mutanter en minskning av dsRNA orsakad av abortivt RNA i reaktionen, vilket tyder på att förlängningskonformationen av dessa polymerasmutanter är mer stabil. Vissa mutanter visade en minskning av loopback-dsRNA-innehåll i reaktionen, vilket indikerar en försvagning av terminal överföringsaktivitet eller RDRP-aktivitet i dessa mutanter.

Med tanke på att prestandafördelarna med de ovan nämnda mutanterna härrör från olika mekanismer, teamet har konstruerat DNA-shuffling-bibliotek som riktar sig mot dem. Efter screening, laget fick slutligen överlägsna mutanter med extremt låg dsRNA-generering samtidigt som det inte påverkar avkastningen och mRNA-integriteten (Figur 2). Utbytet av en mutant G47A+884G som upptäcktes av Moderna påverkades dock^[5] (opublicerad).

Figur 2. Enzymutvecklingsprocess och karakterisering av mutantprestanda

(opublicerad)

Analys av dsRNA-generering av T7 RNA-polymeras varianter?

Efter kvantitativ analys, som visas i figur 3, med användning av en 9 kb transkriptionsmall under co-transkriptionsskyddsförhållanden, producerade vildtyp T7 RNA-polymeras cirka 2,9 ng/μg dsRNA vid användning av naturliga nukleotider, medan en kommersiell T7 enzym producerade cirka 0,18 ng/μg dsRNA. Emellertid dsRNA-produktionen av varje T7 RNA-polymerasvariant konstruerad var mindre än 0,10 ng/μg. Särskilt en variant var bara 0,015 ng/μg, nästan 200 gånger lägre än vildtypen och 12 gånger lägre än den kommersiella produkt. Efter upprepade tester observerades prestandafördelen med varianterna för att reducera dsRNA konsekvent under olika reaktionsförhållanden, vilket indikerar god systemkompatibilitet för dessa mutanter och lägger en grund för att ytterligare minska dsRNA-produktionen genom reaktionsbuffert optimering. Dessutom erhöll FADS-screening även flera varianter med förbättrad produktintegritet och termisk stabilitet, vilket kan uppfylla kraven för ett bredare spektrum av in vitro-transkriptionstillämpningar

Figur 3. Utvärdering av dsRNA-generering av T7 RNA-polymerasvarianter utvärderade med Yeasen dubbelsträngat RNA (dsRNA) ELISA Kit och J2-antikroppsdot blot-analys.

I dagsläget har flera partners redan provat T7 RNA-polymerasvarianterna och vi har fått mycket beröm från dem. Användningen av det nya enzymet förenklar mRNA-reningsprocessen, förbättrar arbetseffektiviteten och visar enastående prestanda i flera tillämpningsscenarier.

Dessa varianter finns i patentansökningar och vi välkomnar diskussioner om tekniksamarbete och licensiering.

Om Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology är ett dotterbolag till Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., specialiserat på att tillhandahålla skräddarsydda lösningar för enzymmodifiering som drivs av enzymutvecklingsteknologi.Utnyttja Yeasens resurser Biotechnology, Molefuture verkar på sex stora tekniska plattformar: ZymeEditors innovativa enzymutvecklingsplattform, en multi-host högeffektiv uttrycksplattform, fermenteringsprocessutvecklingsplattform, reningsprocessutvecklingsplattform, ultrarena enzymproduktionsplattform och enzymanalys- och kvalitetskontrollplattform. Med dessa sex tekniska plattformar kan Molefuture erbjuda en komplett uppsättning skräddarsydda lösningar inklusive enzymriktad evolution, utveckling av nya enzymer, utveckling av enzymprocesser och uppskalning på GMP-nivå för att möta applikationskraven från enzymer inom områden som in vitro-diagnostik, biomedicin, syntetisk biologi, medicinsk estetik, farmaceutiska intermediärer. al.

Beställningsinformation

Följande är representativa produkter som erbjuds av Yeasen. Ytterligare storlekar finns tillgängliga. Våra produkter är mycket optimerade för att fungera tillsammans, för att säkerställa överlägsen prestanda och reproducerbarhet. Vi kan även erbjuda skräddarsydda tjänster. Om du är intresserad av en produkt som inte visas, kontakta oss så hjälper vi dig att möta dina behov.

Angående läsning:

Dela valideringsrapporten för det dubbelsträngade RNA (dsRNA) ELISA-kitet för att främja standardisering av dsRNA-detektion.

Referenser:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA-polymeras[J]. Framsteg inom nukleinsyraforskning och molekylärbiologi, 2003: 1-41.

[2] Steitz TA. De strukturella förändringarna av T7 RNA-polymeras från transkriptionsinitiering till förlängning[J]. Aktuell opinion i strukturbiologi, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Fluorescensaktiverad droppsortering för encellsriktad evolution[J]. ACS syntetisk biologi, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. 3′-ändadditioner av T7 RNA-polymeras är RNA-självtemplaterade, distribuerande och mångsidiga till sin karaktär—RNA-Seq-analyser[J]. Nukleinsyraforskning, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Ett konstruerat T7 RNA-polymeras som producerar mRNA fritt från immunstimulerande biprodukter[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.