Letar du efter ett tillförlitligt sätt att detektera kvarvarande dsRNA under mRNA in vitro-transkription? Leta inte längre än det dubbelsträngade RNA (dsRNA) ELISA Kit. Men med flera kommersiella kit tillgängliga, är det viktigt att notera att valideringsdata kanske inte alltid är offentligt tillgängliga, vilket leder till inkonsekvens i dsRNA-detektion. Det är därför vi delar med oss av vår valideringsrapport för ELISA-kit med dubbelsträngat RNA (dsRNA), som täcker specificitet, precision, noggrannhet, känslighet och hållbarhet. Denna rapport fungerar som en referensguide för att validera resterande dsRNA-detektionsmetoder som är skräddarsydda för specifika experimentella förhållanden och regulatoriska farmakopéstandarder. Läs mer om vår valideringsrapport för att främja standardisering av dsRNA-detektion.
Dubbelsträngad RNA (dsRNA) ELISA Kdet
Bakgrund:
Det dubbelsträngade RNA (dsRNA) ELISA-kitet är ett reagenskit utformat för att detektera kvarvarande dsRNA som produceras under mRNA in vitro-transkriptionsprocessen. Med hjälp av den experimentella principen med dubbel antikroppssandwich-enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) och biotin-streptavidin-amplifieringssystemet, erbjuder detta kit känslig detektion av kvarvarande dsRNA i prover.
Sammanfattningsdata innehåller valideringsparametrar som täcker specificitet, precision, noggrannhet, känslighet och hållbarhet. Rapporten fungerar som en referensguide och uppmanar användare att validera metoder för detektion av resterande dsRNA som är skräddarsydda för deras specifika experimentella förhållanden och som följer regulatoriska farmakopéstandarder.
Material och metoder:
Utrustning: Dubbelsträngat RNA (dsRNA) ELISA-kit: Cat#36717ES (YEASEN). Satsen innehåller fyra olika typer av dsRNA-standardprover. Användare har möjlighet att välja den standardprovtyp som överensstämmer med deras specifika process för att generera standardkurvan, och därigenom undviker behovet av att förbereda och testa alla prover.
Metoder: Materialen och förfarandestegen som är väsentliga för experimentet specificeras huvudsakligen av Yeasen Biotechnology. Satsen har genomgått omfattande testning och utvärdering, vilket säkerställer att dess prestanda uppfyller de fastställda kraven i ICH Q2(R1) och 2020 års upplaga av den kinesiska farmakopén, del fyra "9101 Analytical Method Validation Guidelines".
Resultat
- Linjäritet för dsRNA-standarder
Denna rapport har utvecklat standardkurvor för alla fyra olika typer av dsRNA-standarder, var och en med en längd på 300 bp. Dessa standarder inkluderar STD1, omodifierat dsRNA; STD2, Pseudo-UTP modifierat dsRNA; STD3, Nl-Me-Pseudo-UTP modifierat dsRNA; och STD4, 5-OMe-UTP modifierat dsRNA. Varje typ av dsRNA-standard uppvisar utmärkt utspädningslinjäritet med R2 > 0,99 och en variationskoefficient (CV) för uppmätt koncentration som är mindre än 10 % som visas i Tabell 1 till Tabell 5.
| STD-namn | Typ UTP | Utspädningens linjäritet (R2＞0,99) | CV |
| STD1 | UTP | 0.0156-1 pg/ μL | ＜10 % |
| STD2 | pUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜10 % |
| STD3 | N1-Mig-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜10 % |
| STD4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/ μL | ＜10 % |
Tabell 1. Linjäriteten för olika dsRNA-standarder.
| STD1 koncn. (pg/μL) | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | Återhämtning | CV |
| 1 | 1,0001 | 100,0 % | 3,1 % |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9 % | 2,4 % |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7 % | 3,3 % |
| 0,125 | 0,1227 | 98,1 % | 0,5 % |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5 % | 3,2 % |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2 % | 1,3 % |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4 % | 3,2 % |
| 0 | / | / | / |
Tabell 2.Återhämtningen och CV av utspädd STD1
| STD2 koncn. (pg/μL) | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | Återhämtning | CV |
| 1 | 1,0001 | 100,0 % | 0,7 % |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9 % | 0,1 % |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6 % | 0,9 % |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6 % | 2,5 % |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6 % | 1,1 % |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9 % | 0,5 % |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6 % | 0,0 % |
| 0 | / | / | / |
Tabell 3. Återhämtningen och CV av utspädd STD2
| STD3 konc. (pg/μL) | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | Återhämtning | CV |
| 2 | 2,0031 | 100,2 % | 1.6 % |
| 1 | 0,9880 | 98,8 % | 2,4 % |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8 % | 1,2 % |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3 % | 2,2 % |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4 % | 0,1 % |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7 % | 1,8 % |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7 % | 1,6 % |
| 0 | / | / | / |
Tabell 4. Återhämtningen och CV av utspädd STD3
| STD4 konc. (pg/μL) | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | Återhämtning | CV |
| 4 | 4,0096 | 100,2 % | 1,9 % |
| 2 | 1,9940 | 99,7 % | 0,7 % |
| 1 | 0,9977 | 99,8 % | 0,1 % |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2 % | 0,1 % |
| 0,25 | 0,2454 | 98,2 % | 5,6 % |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5 % | 2,8 % |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9 % | 0,3 % |
| 0 | / | / | / |
Tabell 5. Återhämtningen och CV av utspädd STD4
-
Specificitet
- Specificitetsanalys med dsRNA, ssRNA, dsDNA och ssDNA.
- Specificiteten påverkades inte av längden på dsRNA.
-
Anoggrannhet
Tillsätter 0,5 pg/μL STD1 till ett känt mRNA-prov med ett dsRNA-innehåll på 0,36 pg/μL genomfördes i tre olika volymförhållanden (1:1, 1:20, 1:250). I samtliga fall föll spikåtervinningsgraden inom intervallet 80-120 %.
Spetsåtervinningsgraden beräknas enligt följande: Spike Återhämtning Rate=(Mätt koncentration efter spik×Totalt volym av spetsad prov - Uppmätt koncentration av de prov×Totalt volym av de prov)/(Teoretisk koncentration av de spike×Volym av de spik)×100 %
| Prover | Volymförhållande av STD1/Sample | Uppmätt dsRNA (pg/μL) | Spika Återhämtning Hastighet |
| Exempel (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:1 | 0,769 | 81 % |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:20 | 0,777 | 82 % |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:250 | 0.803 | 82 % |
Tabell 6. Spetsåtervinningsgraden analys
-
Precision
- Intra-assay precision
Experiment utfördes på tre koncentrationsnivåer (hög, medium och låg) för vart och ett av de fyra dsRNA-standardproverna. Inom ett enda experiment genomgick varje koncentrationsprov åtta upprepade tester. Resultaten visar att variationskoefficienten (CV) är under 15 % indikerar en god intra-analysprecision.
| STD1 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Repliker | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1,0002 | 3,11 % |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46 % |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18 % |
| STD2 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Repliker | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1,0001 | 0,65 % |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2,46 % |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02 % |
| STD3 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Repliker | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 2 | 8 | 2,0022 | 1,58 % |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2,17 % |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64 % |
| STD4 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Repliker | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 8 | 8 | 8,0803 | 0,27 % |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12 % |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76 % |
Tabell 7. Precisionsanalys inom analys
- Inter-assay precision
Tre experiment utfördes med hjälp av kit från 3 partier. I varje experiment valdes höga, medelhöga och låga koncentrationer och testades tre gånger för vart och ett av de fyra dsRNA-standardproverna, med åtta replikat. Följaktligen förvärvades 24 datapunkter vid varje koncentrationsnivå, som sedan användes för analys av variationskoefficient (CV). Resultaten visar att CV för varje koncentration av standarderna var under 15 %.
| STD1 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Oberoende tester/replikat | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 1,0007 | 2,38 % |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3,20 % |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27 % |
| STD2 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Oberoende tester/replikat | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09 % |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06 % |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52 % |
| STD3 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Oberoende tester/replikat | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 2 | 3/8 | 2,0012 | 2,37 % |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14 % |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81 % |
| STD4 | |||
| Teoretisk konc. (pg/μL) | Oberoende tester/replikat | Uppmätt medelvärde (pg/μL) | CV |
| 8 | 3/8 | 7,9735 | 1,89 % |
| 1 | 3/8 | 1,0225 | 0,13 % |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5,63 % |
Tabell 8. Precisionsanalys mellan analyser
-
Känslighet
- LOD
Detektionsgränsen för utrustning bestäms genom att addera två gånger standardavvikelsen till medelvärdet av blankvärdena. Genom att mäta OD för 24 blankämnen, beräkna deras medelvärde och standardavvikelse och sedan applicera dessa värden på den anpassade kurvan, motsvarande detektionsgräns erhålls.
|
| OD |
| ||
| dsRNA Standard | Medelvärdet av Blank | SD av Blank | Medelvärdet för Blank+2SD | LOD |
| STD1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001 pg/μL |
| STD2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001 pg/μL |
| STD3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001 pg/μL |
| STD4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01pg/μL |
Tabell 9. LOD-analys
- LOQ
Den kvantitativa gränsen för utrustning fastställs genom att späda ut den lägsta koncentrationspunkten på standardkurvan till ännu lägre nivåer, vilket säkerställer en CV < 20 % vid den lägsta koncentrationen, och därigenom definierar det kvantitativa tröskelvärdet. LOQ är följande.
| dsRNA Standard | LOQ | Repliker | CV(%) | Återhämtning (%) |
| STD1 | 0,0156 pg/μL | 24 | ＜10 % | 80~120% |
| STD2 | 0,0312 pg/μL | 24 | ＜10 % | 80~120% |
| STD3 | 0,0156 pg/μL | 24 | ＜10 % | 80~120 % |
| STD4 | 0,125 pg/μL | 24 | ＜10 % | 80~120% |
-
Dhållbarhet
- Anti-interferens på IVT-material
Detta test syftar till att bedöma effekten av olika enzymer, buffertar, etc. som läggs till mRNA prov på dsRNA-detektering av kitet.
Lägga till specifika koncentrationer av T7 RNA-polymeras, RNAse-hämmare, IPPA (oorganiskt pyrofosfatas), DNas I, VCE (vaccinia-capping-enzym), 2'-O-Methyltransferas (MT), 1×IVT-buffert och 1 mM natriumcitrat till ett tillhandahållet mRNA-prov, och sedan använda STD3 för både standardkurvberedning och provtestning, möjliggjorde utvärderingen av kitets förmåga att detektera dsRNA-innehåll i dessa prover. Resultaten visar att närvaron av åtta olika enzymer och buffertar inte påverkade den exakta detekteringen av dsRNA. Dessutom föll de observerade återhämtningsgraderna inom intervallet 80 % till 120 %.
| IVT-material | dsRNA Uppmätt (pg/μL) | Återhämtning |
| Ingen | 0,6057 | 100 % |
| T7 RNA-polymeras (15 μg/ml) | 0,5411 | 89,32 % |
| Murin RNas-hämmare (27,5 μg/ml) | 0,5142 | 84,88 % |
| Oorganiskt pyrofosfatas (IPPA 10μg/mL) | 0,7132 | 117,7 % |
| DNas I (13,75 μg/ml) | 0,6077 | 100,32 % |
| Vaccinia Capping Enzyme (10 μg/ml) | 0,6563 | 108,3 % |
| 2´-O-metyltransferas (10 μg/ml) | 0,5776 | 95,4 % |
| 1×IVT buffert | 0,5003 | 82,6 % |
| 1 mM Natriumcitrat | 0,6251 | 103,2 % |
Tabell 11. Återvinningen av utspädd STD3 tillsatt med IVT-material
- Temperatur dhållbarhet
Kiten förvarades hos båda 4°C och 37°C för att detektera koncentrationsvariationerna för dsRNA-standard efter 7 dagar. Resultaten visar att varianserna alla ligger inom 20 %.
| dsRNA Standard | dsRNA Uppmätt (pg/μL) Dag 0 | Varianserna efter 7 dagar vid 4°C |
| STD1 | 1 | 10 % |
| STD2 | 1 | 5 % |
| STD3 | 2 | 7 % |
| STD4 | 4 | 11 % |
| dsRNA Standard | dsRNA Uppmätt (pg/μL) | Varianserna efter 7 dagar vid 37°C |
| STD1 | 1 | 18 % |
| STD2 | 1 | 4 % |
| STD3 | 2 | 5 % |
| STD4 | 4 | 8 % |
Tabell 12. Temperaturbeständighetsanalys
Relaterad produkt:
| Produktnamn | SKU | Specifikationer |
| Dubbelsträngat RNA (dsRNA) ELISA-kit | 36717ES | 48T/96T |
| CleaScrip™ T7 RNA-polymeras (lågt ds-RNA, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| T7 RNA-polymeras GMP-klass (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
Relaterad läsning:
Dubbelsträngat RNA (dsRNA) ELISA-kitet användes för att validera T7-RNA-polymerasmutanter med lågt dsRNA, i kombination med J2-antikroppspunktblottingmetoden.
Lågt dsRNA T7 RNA-polymerasmutanter, stärker utvecklingen av mRNA-vaccin och terapi
Referenser:
- ICH, 2022: Analytical Method Validation Q2, utkastversion.
- NMPA, 2007: Allmänna principer för utvärdering av analytisk metodvalidering för analys av biologisk produktkvalitetskontroll
- Chinese Pharmacopoeia Commission (ChPC), 2020: Chinese Pharmacopoeia, Del fyra: Riktlinjer för validering av kvantitativa analysmetoder för biologiska prover