Under de senaste åren har mRNA-baserade läkemedel fått stor uppmärksamhet och väckt forskningsfokus. T7 RNAP är känt för sin enkelhet och förmåga att katalysera RNA-syntes med högt utbyte och trohet in vitro. Men under transkriptionsprocessen kan T7 RNAP producera biprodukter såsom misslyckade korta RNA, för tidigt avslutade RNA och 3'-förlängda RNA, vilket skapar gynnsamma förhållanden för bildandet av dsRNA. Därför har minskad produktion av dsRNA blivit ett akut behov i praktiska tillämpningar.
Nyligen, en banbrytande studie med titeln "FADS och semi-rationell designmodifierad T7 RNA-polymeras reducerade dsRNA-produktion, med lägre terminal transferas och RDRP-aktiviteter" publicerades online av Yeasen och Molefuture Team. Forskare konstruerade framgångsrikt T7 RNAP för att avsevärt minska produktionen av dsRNA-biprodukter under transkription, vilket minskade den till 1,8% av vildtypsenzymet genom en kombination av riktad evolution och semi-rationell design.
FADS-baserad screening av T7 RNAP
För screening av T7 RNAP valdes FADS (Fluorescensaktiverad droppsortering) för att möta kraven på hög genomströmning av proteinutveckling. För att förhindra för tidig fragmentering av celler använde forskare ett PDMS-chip med dubbla vattenfaser, där lysozym blandades med cellerna på chipet och utövade sin aktivitet i dropparna Figur 1. Forskare genererade flera slumpmässiga mutantbibliotek med en mångfald från 105 till 106, Efter screening identifierades 10 dominanta varianter och betecknades som Mut1 till Mut10. Som visas i Figur 2E och Figur 2F, var dsRNA-innehållet i Mut1, Mut7 och Mut9 signifikant lägre än det för vildtypen
Figur 1. Översikt över FADS
Figur 2. Slumpmässig biblioteksscreening och variantutvärdering
Semi-rationell design av T7 RNAP
Forskare genomförde en semi-rationell designutforskning, skapade tio mättade bibliotek på en plats och använde den traditionella mikrotiterplattbaserade dubbla probesmetoden för screening (Figur 3). Den tillsatta 5'-ändproben används för detektion av RNA-utbyte.
Figur 3. Strukturstyrd semi-rationell design för minskat dsRNA
Efter screening av över 1000 mutanter, forskare identifierade sex kandidater: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) och Mut16 (I743L). Det totala RNA-utbytet av alla sex mutanter skilde sig inte signifikant från vildtypen, vilket indikerar jämförbar total transkriptionseffektivitet. Förväntat var dsRNA-innehållet i Mut11 och Mut14 signifikant lägre jämfört med vildtyp(Figur 4).
Figur 4. Mikrotiterplattscreening och variantutvärdering
Mut17 från DNA-shuffling ger mindre dsRNA
För att ytterligare optimera T7 RNAP valdes de fyra varianterna med lågt dsRNA-innehåll samtidigt som produktionskraven uppfylldes.Forskare konstruerade sedan ett DNA-shuffling-bibliotek och screenade med mikrotiterplattor, identifierade en variant som uppvisade lägre dsRNA-produktion jämfört med dess parentala T7 RNAP, som heter Mut17 (A70Q/F162S/K180E). De analyserade därefter transkriptionsprodukterna av Mut17 och dess föräldravarianter (Mut14, Mut11 och Mut7). Som visas i Bild 5alla fyra varianterna uppvisade signifikanta minskningar i dsRNA-produktion under transkription jämfört med vildtypen. Anmärkningsvärt nog visade Mut17 signifikant lägre dsRNA-innehåll på endast 1,80% och så lågt som 0,007 ng/μg i lösningsmedelssystemet för screening.
Figur 5. dsRNA-innehåll i Mut17 och dess föräldramutationer
Immunogeniciteten för IVT-produkten från mutanten är signifikant lägre än den för vildtypen.
Nästa, Vi utvärderade immunogeniciteten hos IVT-produkterna i murin RAW264.7 celler. Som visas i figurerna 2A och 2B reducerades IFN-p-mRNA och proteinnivåer i RAW264.7-celler transfekterade med mRNA producerat av mutanter jämfört med vildtyp, vilket indikerar att mRNA syntetiserat av vildtyp T7 RNAP framkallade det starkaste immunsvaret, medan mRNA från mutanterna visade en signifikant reducerad respons. Specifikt var IFN-β-mRNA från celler behandlade med Mutll RNA endast 9,7 % av de vildtypsbehandlade cellerna, och dess protein var 12,93 pg/ml. Dessutom visade uttrycket av EGFP inga signifikanta skillnader i kvantitet eller kvalitet bland mRNA genererade av olika T7 RNAPs (Figur 6C), som uppfyller kraven för industriella tillämpningar.
Figur 6. IFN-β-svar och EGFP-uttryck i däggdjursceller
Mutantens RDRP och terminala transferasaktiviteter är mycket lågavir än de av vildtypen.
För att undersöka effekten av mutationer på att minska dsRNA, forskare genomfördes i silicostudier på alla dessa mutationer. Resultatet tyder på en tydlig indikation på minskad RDRP-aktivitet i varianterna, eftersom de visar en minskad tendens att använda RNA som mall. På liknande sätt kan detta ha haft en inverkan på den terminala transferasaktiviteten hos T7 RNAP. Som visas i Figur 7under olika koncentrationer uppvisade alla fyra varianterna mindre än 50 % av fluorescensvärdet jämfört med vildtypen.
Därefter användes en 3'-änds heterogenitetsanalys för att karakterisera den terminala överföringsaktiviteten av T7 RNAP. När man fokuserar på andelen RNA med n>0, vilket återspeglar den terminala transferasaktiviteten, forskare fann att dessa RNA stod för 82,94 % i vildtypen, medan mutanterna uppvisade följande procentandelar: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) och Mut17 (55,62%) (Figur 8). Viktigt är att dessa procentsatser i hög grad överensstämmer med mängden dsRNA i produkterna (Figur 5). Dessa resultat indikerar en signifikant minskning av terminal transferasaktivitet hos mutanter, vilket, tillsammans med minskningen av RDRP-aktivitet, bidrar till minskningen av dsRNA.Specifikt kan den terminala transferasaktiviteten spela en mer avgörande roll, vilket framgår av den lägsta ackumuleringen av n>0 RNA som observerats i Mut17, som också uppvisar den lägsta dsRNA-produktionen (Figur 5 och Figur 8).
Figur 7. Relativ RDRP-aktivitet
Figur 8. Heterogenitet i 3'-änden av RNA-produkter
Slutsats
Denna studie levererar en robust metod för att identifiera mutanter med reducerat dsRNA-innehåll och isolerar framgångsrikt flera dsRNA-mutanter som har minskat RNA-beroende RNA-polymeras och terminal transferasaktivitet. Det stärker avsevärt valideringen av säkerhet och effekt som är integrerad i mRNA-terapi, vilket understryker dess djupgående implikationer för att utveckla mRNA-vacciner och genterapiapplikationer.
Samtidigt har moderbolaget Yeasen har även lanserat en T7 RNAP-produkt som avsevärt minskar dsRNA innehåll. Flera partners har redan testat de modifierade T7 RNAP-mutanterna utvecklade av Molefuture och produkten har blivit mycket erkänd av kunderna. Våra kunder tror att användningen av det nya enzymet förenklar reningsprocessen av mRNA och reducerar kraftigt immunogeniciteten hos IVT produkter, visar enastående prestanda i flera tillämpningsscenarier, vilket bevisar sin breda potentiella tillämpning inom biofarmaceutiken!
Beställningsinformation
Följande är representativa produkter som erbjuds av Yeasen. Ytterligare storlekar finns tillgängliga. Våra produkter är mycket optimerade för att fungera tillsammans, för att säkerställa överlägsen prestanda och reproducerbarhet. Vi kan även erbjuda skräddarsydda tjänster. Om du är intresserad av en produkt som inte visas, kontakta oss så hjälper vi dig att möta dina behov.