Nästa generations sekvensering (NGS) har visat extremt breda tillämpningsmöjligheter för klinisk och vetenskaplig forskning inom områden som patogendetektion, tumörmutationsdetektion och reproduktiv genetik på grund av dess höga detektionskänslighet, starka specificitet och förmågan att utföra både kvalitativ och kvantitativ detektion. Bibliotekskonstruktion, som ett centralt steg i NGS, påverkar direkt sekvenseringskvaliteten. Baserat på riktlinjerna för registreringsgranskning för produkter för in vitro-diagnostik (IVD), måste forskningsdata för de viktigaste råvarorna tillhandahållas. En omfattande analys och verifiering bör utföras genom att kombinera faktorer som basinformation, parameterindikatorer och försörjningskällor för råvarorna för att fastställa den mest lämpliga råvarukällan. Den konventionella DNA- och RNA-bibliotekskonstruktionsprocessen inkluderar huvudsakligen nyckelsteg som cDNA-syntes, DNA-fragmentering, adapterligering och biblioteksamplifiering, De olika stegen innehåller många typer av råvaruenzymer. Omfattningen av screeningen av råvaruenzymer förlänger forskningscykeln. På grundval av detta har kostnadseffektiva och enkla bibliotekskonstruktionsmodulprodukter blivit ett nytt val för utveckling av IVD-produkter.
Figur 1. Konstruktionsprocess för konventionella DNA-bibliotek (vänster) och konstruktionsprocess för RNA-bibliotek (höger), med Illumina-plattformen som ett exempel
Omvänd transkriptionssyntes är kärndelen av RNA-Seq, Ny typ av hög effektivitet omvänt transkriptas, som integrerar flera funktioner såsom hög känslighet, hög avkastning av cDNA, och kompatibilitet med mallar av komplexa strukturer, är en forskningshotspot. ZymeEditor™-enzymmodifieringsplattformen från Yeasen har erhållit en allsidig omvänd transkriptionsprodukt med omfattande förbättrad prestanda genom riktad modifiering av M-MLV. Den kan användas i flera tillämpningsscenarier såsom RNA-seq, enkelcellssekvensering, cDNA-kloning och bibliotekskonstruktion.
Figur 2. Prestanda för 13488ES applicerad i RNA-seq
Begränsad av den korta läslängden på sekvenseringsplattformen måste DNA fragmenteras slumpmässigt före bibliotekskonstruktion. I det tidiga skedet var enzymatisk fragmentering skrämmande på grund av problem med enhetlighet och partiskhet. Yeasen Bioteknik har utvecklat två unika fragmenteringsenzymer, Ett kraftigt verkande fragmenteringsenzym som fungerar vid 37 ℃ i 3-30 minuter och ett milt verkande fragmenteringsenzym som fungerar vid 30 ℃ i 10-40 minuter. Enzymatiska fragmenteringsprodukter baserade på slumpmässig fragmentering förbättrar gradvis sina brister, De kombineras till modulära produkter för DNA-fragmentering, slutreparation och A-tailing som uppfyller de många kraven från olika prover och olika sekvenseringstyper.
Figur 3. Fragmenteringseffekter av olika DNA-fragmenteringsenzymer: kraftfullt verkande fragmenteringsenzym (vänster) och milt verkande fragmenteringsenzym (höger)
Bibliotekets konverteringsfrekvens är en viktig indikator för att utvärdera bibliotekets kvalitet. En hög bibliotekskonverteringsfrekvens betyder i viss mån bättre biblioteksrikedom och bättre enhetlighet i sekvenseringsdata. Konventionellt T4 DNA-ligas fokuserar på att optimera högeffektiv ligering, men fragment är benägna att självligera, vilket minskar bibliotekets omvandlingshastighet och påverkar bibliotekets rikedom och sekvenseringskvalitet. Yeasen ZymeEditor™ enzymteknikplattform genomför riktningsmodifiering på T4 DNA Ligase för att erhålla en ny mutant, I kombination med en noggrant optimerad ligeringsbuffert har ligeringsmodulprodukten med hög termisk stabilitet och låg fragmentsjälvligeringshastighet utvecklats, vilket avsevärt förbättrar bibliotekets omvandlingshastighet.
Figur 4. Termisk stabilitet och länkresteranalys av 12996ES
PCR-amplifieringsenzymer krävs alla i NGS-bibliotekets beredningsmetoder. De flesta high-fidelity DNA-polymeraser har 5'→3'-polymerasaktivitet och 3'→5'-exonukleasaktivitet, Den kan syntetisera DNA i 5'→3'-riktningen samtidigt som den korrigerar de felaktigt inkorporerade baserna, Således kan den snabbt och med hög trohet amplifiera DNA-fragment. Men få enzymer är speciellt designade för NGS, Det finns inte många biblioteksförstärkningsprodukter som är effektiva, exakta, specifika och kan amplifiera mål av olika storlekar och GC-innehåll utan bias, och som samtidigt har förmågan att förmixa primers i förväg. Yeasen Biotechnology har utvecklat ett mycket noggrant DNA-polymeras med en unik design och en optimerad varmstart PCR-premix, den är speciellt designad för effektiv, högtrogen och låg-bias NGS-biblioteksförstärkning, vilket tar itu med utmaningarna med komplex NGS-biblioteksförstärkning.
Figur 5. Analys av stabilitet och förstärkningsfelfrekvens för 12980ES
Förutom ovanstående serie av NGS-bibliotekskonstruktionsmodulprodukt, Vi tillhandahåller också råa enzymprodukter i ett enda tillfälle, för att möta olika kunders kombinerade behov. Yeasens NGS-biblioteks konstruktionsråvaruprodukter genomgår strikta fabrikskvalitetskontrollstandarder, strikt batchprestanda och stabilitetskvalitetskontroll, så att du kan bygga bibliotek utan oro.
| Produktkategori | Produktnamn | Kat.nr. | Anmärkning |
| Effektiv cDNA-syntes | Hifair™ Ultra omvänt transkriptas (200 U/μL) | 14604ES | Omvänd transkriptionsenzym |
| Hieff NGS™ ds-cDNA-syntessats | 13488ES | cDNA-syntesmodul | |
| DNA Fragmentering & End-Repair & A- Tailing | Hieff™ Smerase | 12907ES | DNA-fragmentas |
| Hieff NGS™ OnePot Pro DNA-fragmenteringsmodul (slutreparation och dA-tailing plus) | 12619ES | DNA Fragmentation & End-Repair & A- Tailing modul | |
| Reparation & A-Tailing | Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module | 12608ES | End-Repair & A- Tailing-modul |
| Adapterligering | 10299ES | T4 DNA-ligas | |
| Biblioteksförstärkning | 2× Ultima HF Amplification Mix | 13344ES | High-fidelity enzym |