Beskrivning
T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimerar transkriptionsreaktionssystemet. Kitet kan syntetisera det enkelsträngade RNA:t effektivt genom att använda T7 RNA-polymeras, det linjära dubbelsträngade DNA:t med T7-promotorsekvensen som mall, NTP:er som substrat för att kontrollera DNA-sekvensen nedströms om promotorn. Under transkription kan modifierade nukleotider läggas till substratet för att framställa biotin eller färgämnesmärkt RNA.
Detta kit kan syntetisera långa transkript och korta transkript, RNA kan produceras 100-200 μg med 1 μg DNA-mallinmatning. Det RNA som syntetiseras genom transkription kan användas för olika nedströmsapplikationer, såsom RNA-struktur- och funktionsforskning, RNas-skydd, sondhybridisering, RNAi, mikroinjektion och in vitro översättning.
Figur 1: In vitro RNA-transkriptionsprocess
Särdrag
- Upp till 180 μg RNA per reaktion från 1 μg av kontrollmallen
- Optimerat reaktionssystem för IVT-processen
- Minska dsRNA-produktionen
- Högre RNA-integritet och renhet
Ansökan
- In vitro RNA-syntes
Komponenter
| Komponentnr. | Namn | 10623ES50 (50 T) | 10623ES60 (100 T) | 10623ES70 (500 T) |
| 10623-A | T7 RNA-polymerasblandning | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-B | 10×Transkriptionsbuffert | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-C | ATP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-D | CTP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-E | GTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-F | UTP (100 mm) | 100 μL | 200 μL | 1 ml |
| 10623-G | Kontroll-DNA-mall (500ng/μL) | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
Frakt och förvaring
Torristransport. Förvaras vid -15℃ ~ -25℃, giltigt i två år.
Siffror
Figur 1. Standard-RNA syntetiserades in vitro med användning av T7 RNA-synteskit.
Reaktionen inkuberades i ett PCR-instrument vid 37°C under 2 timmar och renades sedan med magnetiska pärlor (Cat #12602). Utbytesresultatet analyserades med NanoDrop-spektrofotometer som visas i figur 1.
Figurer 2. Transkriptionsdemonstrationen av olika längder av RNA med T7-kit i respektive elektroforetogram (figur 2A), kapillärelektroforesdiagram (figur 2B) och kromatogram (figur 2C)
Figur 3. Syntes av kapslad RNA in vitro.
Reaktionen inkuberades i PCR-instrument vid 37°C under 2 timmar och renades sedan med magnetiska pärlor (Cat #12602). Utbytesresultatet analyserades med NanoDrop-spektrofotometer som visas i figur 3A. Integritetsresultatet analyserades genom kapillärelektrofores som visas i figur 3B.
1. Lågt avskriftsutbyte
Kvaliteten på mallen är nära relaterad till avkastningen. Om utbytet av experimentgruppen är betydligt lägre än kontrollgruppen, är de möjliga orsakerna:
① den experimentella mallen innehåller hämmande komponenter;
② Mallen har något fel.
Förslag:
① Rensa mallen igen;
② Bestäm mallens kvantifiering och dess integritet;
③ Förläng reaktionstiden;
④ Öka mängden mallinmatning;
⑤ Prova andra promotorer och RNA-polymeraser.
2. Lågt utbyte av korta avskrifter
Ett kort transkriptionsinitieringsfragment kommer att hämma reaktionen. När transkriptionsprodukten är mindre än 100 nt ökar RNA-utbytet genom att förlänga reaktionstiden till 4-8 timmar eller öka mängden mall till 2 μg.
3. RNA-transkriptionslängden är större än förväntat
Om elektroforesen visar att produktbandet är större än den förväntade storleken, de möjliga orsakerna:
① Plasmidmallen kanske inte är fullständigt linjäriserad;
②3'-änden av avkänningssträngen har en framträdande struktur;
③ RNA:t har en sekundär struktur som inte är helt denaturerad.
Förslag:
①Kontrollera om mallen är helt linjäriserad, och vid behov, utför ytterligare linjärisering;
②Välj ett lämpligt restriktionsenzym för att undvika 3'-överhäng, eller använd Klenow Fragment /T4 DNA-polymeras för att slutföra transkriptionen innan du fortsätter;
③Använd denaturerad gel för att detektera RNA-produkter.
4. RNA-transkriptionslängden är mindre än förväntat
Om elektroforesen visar att produktbandet är mindre än den förväntade storleken, de möjliga orsakerna:
① Mallen innehåller en termineringssekvens som liknar T7 RNA-polymeras;
②GC-innehållet i mallen är högt.
Förslag:
①Sänk reaktionstemperaturen (till exempel 30°C). Ibland kan en sänkning av temperaturen öka transkriptionslängden, men det kommer att minska utbytet. Eller prova olika RNA-polymeraser för transkription;
②Om mallens GC-innehåll är högt, använd 42℃ för att transkriptera, eller lägg till SSB för att öka utbytet och transkriptionslängden.
5. Elektrofores-svansning av transkriptionsprodukter
Det finns ett svansfenomen under elektrofores.
Möjliga orsaker:
① Förorenad av RNas under experimentell drift;
② Förorenad DNA-mall av RNas.
Förslag:
①Använd RNase-fria pipettspetsar och EP-rör, använd latexhandskar och engångsmasker, och alla reagenser är förberedda med RNase-fritt H2O.
②Rena mallens DNA igen.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis mikroRNA-liknande RNA 8 (Nb-milR8) Ökar svamppatogenicitet genom att modulera BmPEX16-genuttryck i dess värd, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Ultrakänslig kvantifiering av cirkulerande miR-195-5p med trippelsträngsförskjutningsförstärkningskaskad. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
Betalning och säkerhet
Din betalningsinformation behandlas säkert. Vi lagrar inte kreditkortsuppgifter och har inte heller tillgång till din kreditkortsinformation.
Förfrågan
Du kanske också gillar
Vanliga frågor
Produkten är endast avsedd för forskningsändamål och är inte avsedd för terapeutisk eller diagnostisk användning hos människor eller djur. Produkter och innehåll skyddas av patent, varumärken och upphovsrätt som ägs av Yeasen Biotechnology. Varumärkessymboler anger ursprungsland, inte nödvändigtvis registrering i alla regioner.
Vissa applikationer kan kräva ytterligare immateriella rättigheter från tredje part.
Yeasen är dedikerad till etisk vetenskap, och anser att vår forskning bör behandla kritiska frågor samtidigt som den säkerställer säkerhet och etiska standarder.