Hieff^™ Fast Cell Direct RT-qPCR Kit baserat på SYBR Grönt färgämne är lämpligt för RNA-extraktion från alla typer av djurceller (som cellinjeväggceller och suspensionsceller, primära odlingsceller, olika stamceller, iPS-celler, etc.), utan att behöva extrahera RNA, och kan användas direkt för qPCR-expressionsanalys, som är kort, lätt att använda och har en låg felfrekvens. Det tar bara 1,5 timmar att slutföra stegen från mallberedning till omvänd transkriptionsreaktion och genuttrycksanalys.

Reagenser för omvänd transkription och fluorescensdetektion ingår i kitet, som kan användas för genuttrycksanalys utan att behöva köpa ytterligare reagenser.

Specifikationer

Komponenter

Lagring

FCD-lysbuffert och FCD-tvättbuffert smältes och lagrades vid 4°C för att förhindra kontaminering. FCD Stop Solution、DNase I、4× Hifair™ FCD RT Mix、2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix ska förvaras vid -25~-15℃.

Instruktioner

1. Beredning av klyvningsprodukter

1)1. Smält reagenset i rumstemperatur, vänd det upp och ner och blanda det försiktigt före användning, och använd det efter lätt centrifugering för att undvika skumning*.

*Underlåtenhet att blanda reagenserna, användning av en oscillator för blandning och underlåtenhet att konfigurera reagenserna på is kan leda till en minskning av reaktionens prestanda.

2) Beroende på celltyp**, överför cellerna till ett centrifugrör och centrifugera vid 5000 rpm i 2 minuter för att samla upp cellerna och aspirera mediet. Om cellerna odlas i 96-brunnars plattor kan mediet aspireras direkt.

3) Tillsätt 150 μL FCD-tvättbuffert till varje brunn, tvätta cellerna genom att blåsa, centrifugera vid 5000 rpm i 2 minuter och aspirera FCD-tvättbufferten***.

​​​​​​4) Tillsätt 48 μL FCD-lysbuffertlösning och 2 μL DNase Ⅰ-lösning till varje brunn, blås och blanda i rumstemperatur, låt det stå i 5 minuter och tillsätt sedan 2.5 μL FCD stopplösning efter inkubation****, och blås sedan och blanda i cirka 5 gånger för att erhålla klyvningsprodukten*****.

** Grundkravet för antalet celler är 1 × 10⁴ celler per brunn, och detta kit kan användas i intervallet 1 × 10³ - 1 × 10⁶ celler. om antalet celler är större kan mängden FCD-lysbuffertlösning och DNaseⅠ-lösning ökas proportionellt efter behov.

*** Centrifugeringsförhållandena varierar från cell till cell, så centrifugera med en hastighet som är lämplig för de celler som används.

**** Tillsätt 2,5 μL FCD-stopplösning till 50 μL lysat och öka mängden FCD-stopplösning efter behov.

***** För långtidsförvaring av cellysproduktlösningar, placera vid -20°C.

5） Smält 4 x Hifair™ FCD RT Blanda i rumstemperatur och blanda med lätt inversion, lägg på is och konfigurera reaktionssystemet enligt tabellen nedan:

*******Rekommenderad användningsnivå är 2-5 μL, försök att inte överstiga 45 %.

1. Omvänd transkription

Pipettera och blanda försiktigt ovanstående beredda reaktionslösning och utför den omvända transkriptionsreaktionen enligt proceduren i tabellen nedan:

* Den rekommenderade temperaturen för omvänd transkription är 55°C. För mallar med högt GC-innehåll eller komplexa mallar kan den omvända transkriptionstemperaturen ökas till 60°C. Den omvända transkriptionsprodukten kan användas direkt för nedströms RT-qPCR-detektion. För att undvika hämning av qPCR-reaktionen av det omvända transkriptionssystemet och för att få rätt Ct-värde (10-35), kan produkten spädas 10-1000 gånger och sedan användas. Om nedströmsexperiment inte utförs under en kort tid, den kan placeras vid -20 ℃ för förvaring.

1. Fluorescens kvantitativ PCR

1）Reaktion system konfiguration

Följande förhållanden rekommenderas för beredning av reaktionslösningen (beredning på is).

*Tillsätt inte mer än 1/10 av RT-qPCR-volymen för den omvända transkriptionsprodukten. hög koncentration av mall leder lätt till ospecifik amplifiering, lämplig utspädning på 5-50 gånger. Den rekommenderade mängden mall är 4 μL, försök att inte överstiga 6 μL. När reaktionsprestanda är dålig kan primerkoncentrationen justeras i intervallet 0,2-1,0 μmol/L.

2）Fluorescens kvantitativ PCR-amplifieringsprocedur (tvåstegsmetod)

3）Snabb amplifieringsprocedur för fluorescerande kvantitativ PCR (tvåstegsmetod)

* Glödgnings-/förlängningstemperaturen och den slutliga förlängningstiden kan justeras på lämpligt sätt enligt de experimentella kraven. Snabbprogrammet är lämpligt för de flesta generna och standardprogrammet kan prövas för individuella komplexa sekundära strukturgener.

Anteckningar

1. Denna produkt är endast avsedd för forskning.
2. Använd labbrockar och engångshandskar, för din säkerhet.

Ver.EN20230908

Dokument:

Manualer

11172-Hieff™ Fast Cell Direct. EN20230908.pdf