Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit (kolumnbaserat) omvandlar snabbt ometylerade cytosiner i DNA-prover till uracil, samtidigt som de lämnar metylerade cytosiner oförändrade. Under högtemperaturbisulfitbehandling denatureras dubbelsträngat DNA till enkelsträngar. I närvaro av HSO3- genomgår cytosinrester deaminering och omvandlas till uracil, med metylerade cytosiner förblir oförändrade. Vid efterföljande PCR-amplifiering ersätts uracil med tymin (T). Omvandlingsprocessen tar bara 5 minuter, och tar emot DNA-inmatning från 100 pg till 2 μg, och uppnår en omvandlingseffektivitet på ≥99 % för ometylerade cytosiner. Det konverterade DNA:t är lämpligt för nedströmsapplikationer såsom PCR-amplifiering och NGS-sekvensering.

Särdrag

Låg ingång: Lämplig för att konvertera prover från 100 pg till 2 μg

Kort konverteringstid: cirka 5 minuter.

Minimal provskada: Upprätthålla god provintegritet efter konvertering.

Hög konverteringseffektivitet: Konverteringsfrekvens ≥99 %, höga konverteringsfrekvenser i regioner med hög GC med låg falsk positiv frekvens.

Lämplig för sällsynta prover, såsom enkelcellig DNA-metyleringskonvertering.

Kan metyleringskonvertering av RNA-prover.

Produkt Komponenter

Notera:

För 10 tester per låda: Tillsätt 4,4 mL vattenfri etanol till tvättlösningen.

För 50 tester per låda: Tillsätt 22 ml vattenfri etanol till tvättlösningen.

Efter tillsats av den vattenfria etanolen, vänd och blanda väl, förvara sedan för framtida bruk. Se till att flasklocket är ordentligt stängt för att förhindra avdunstning av etanol, vilket kan påverka reagensens prestanda.

Figur

Figur 4. Bisulfitkonvertering på humana genomiska DNA-prover utfördes med både 12225 och konkurrerande Q-omvandlingssatser. Därefter användes metyleringsspecifika enkelsträngade DNA-biblioteksberedningssatser för att generera bibliotek. Bibliotekets avkastning och kvalitetskontrolldata presenteras ovan. Resultaten visar att vid sekvensering av de poolade biblioteken från både 12225 och konkurrerande Q-kit, gav 12225-kitet högre datautdata, uppnådde en högre målkvot (%) och uppvisade lägre dupliceringsfrekvenser (%).

Frakt och förvaring

Förvara 12225-A omvandlingslösning i rumstemperatur, skyddad från ljus. Förvara andra komponenter i rumstemperatur. Hållbarheten är 12 månader.

Notera:

1. För att säkerställa framgången med nedströmsexperiment, kvantifiera den totala mängden ingående DNA korrekt under omvandlingssteget. Det rekommenderas att använda Qubit 3.0/4.0 för DNA-kvantifiering, med ett A260/A280-förhållande mellan 1,7 och 1,9. Inmatnings-DNA-intervallet bör vara mellan 100 pg och 2 μg, med ett optimalt intervall på 100 ng till 1 μg. Otillräcklig DNA-inmatning kan hindra nedströmsdetektering, medan överdriven input kan minska återhämtnings- och konverteringseffektiviteten.

2. Omvandlingslösningen, desulfoneringslösningen och tvättlösningen innehåller flyktiga komponenter. Efter användning, dra omedelbart åt locken och förvara i rumstemperatur.

3. För efterkonverteringsprover, fortsätt med nedströmsexperiment omedelbart. För korttidsförvaring, förvara vid -20°C, och för långtidsförvaring, förvara vid -80°C.

4. För din säkerhet och hälsa, bär en labbrock och engångshandskar under drift.

5. Denna produkt är endast avsedd för forskning!

Instruktioner

Beredning av reagens och förbrukningsmaterial: 1,5 mL sterilt centrifugrör, enzymfritt vatten, absolut etanol, PCR-rör;

l Bisulfitomvandling:

1) Förbered motsvarande sterila PCR-rör enligt antalet prover som ska testas och förbered reaktionssystemet enligt följande tabell:

2) Transformationssystem

Använd en pipett för att blåsa och blanda ovanstående system eller vortexa och blanda det i 5 s, centrifugera det sedan en kort tid och centrifugera reaktionslösningen till botten av PCR-röret.

v Obs: 1. Vid denna tidpunkt är den totala volymen av reaktionslösningen i PCR-röret 200 μL. För att göra omvandlingen mer komplett bör reaktionslösningen delas upp i lika delar och överföras till ett nytt sterilt PCR-rör efter blåsning och blandning i steg 2), och transformationsproceduren bör köras. Efter omvandlingen kombinerades reaktionslösningarna i de två PCR-rören i samma reningskolonn för rening.

2. Om provvolymen är mellan 20 och 40 μL, minska volymen av transformationslösningen för att bibehålla en total volym på 200 μL.

3. Om provvolymen är 50 μL, tillsätts 150 μL av transformationslösningen, den totala volymen hålls vid 200 μL och omvandlingstiden förlängs till 6-10 min.

3) Inställning av CT-konverteringsprogram

PCR-röret placeras på ett PCR-instrument med ett förinställt program för att utföra reaktionen.

l Rening

1) Tranfer 200 μL av omvandling lösning på Purification kolumnscentrifugera i 30-60 s 13000 gkassera filtratet och placera reningskolonnen i Cuppsamlingsrörs igen;

2) Tillsätt 100 μL av Tvättbuffert till Reningskolonner (bekräfta att absolut etanol har tillsatts), centrifugera i 30-60 s 13000 gkassera filtratet och placera reningskolonnen i Cuppsamlingsrörs igen;

3) Tillsätt 200 μL av Desulfoneringsbuffert in i Reningskolonner och låt reaktionen stå vid rumstemperatur i 20 min. Efter reaktionen, centrifugera i 30-60 s 13000 gkassera filtratet och placera Reningskolonner i Cuppsamlingsrörs igen;

4) Tillsätt 200 μL av Tvättbuffert till Reningskolonnercentrifugera i 30-60 s 13000 g kassera filtratet och placera Purification kolumns i Cuppsamlingsrörs igen;

5) Upprepa steg 4) en gång;

6) Överför Reningskolonner till det förberedda 1,5 mL centrifugröret, tillsätt 10-30 μL av Elueringsbuffert till mitten av filtermembranet efter att ha öppnat locket och torkat, och samla upp DNA efter att ha stått i 1 min vid rumstemperatur och centrifugering i 1 min vid 13000 g;

7) Förvara DNA tillfälligt vid -20 ℃. För långtidsförvaring, vänligen förvara DNA vid -80 ℃ och undvik onödig upprepad frysning och upptining.

Obs: Den renade transformationsprodukten kan användas direkt i den efterföljande PCR-reaktionen eller sekvenseringsprocessen.

Manuell