Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2 är ett DNA&RNA-sambibliotekskit för Illumina®&MGI®-sekvenseringsplattform, som innehåller effektivt cDNA-syntesreagens och enzymnedbrytningsreagens. Jämfört med det traditionella biblioteket konstruktion metod, kan denna produkt effektivt slutföra cDNA-syntes och DNA & RNA-bibliotek konstruktion i ett rör. Satsen innehåller högkvalitativt enzym för DNA-fragmentering och kombinerar DNA-fragmentering, ändreparation och dA-tailing i ett steg, vilket avsevärt minskar tid och kostnad för biblioteksberedning. Detta biblioteksförberedande kit har en utmärkt biblioteksomvandlingshastighet och är tillämplig för prover från alla vanliga djur, växter, mikroorganismer, etc., och även FFPE-proverna. Detta uppgraderade kit som använder det senaste optimerade ligaset minskar avsevärt självligeringshastigheten under adapterligering. Dessutom förbättrar introduktionen av ett nytt high-fidelity-polymeras ytterligare homogeniteten och troheten för amplifiering.

Alla komponenter som tillhandahålls av satsen har genomgått strikt kvalitetskontroll och funktionsverifiering, vilket säkerställer stabiliteten och repeterbarheten av bibliotekskonstruktionen i största utsträckning.

Specifikationer

Komponenter

Notera: * indikerar att detta reagens inte ingår i detta kit och att ytterligare reagens krävs. Satsen är kompatibel med dubbla plattformar av Illumina^®&MGI^®, men ytterligare primerblandning (CAT # 13334 Primer Mix för MGI^® och Cat# 13335 Primer Mix för Illumina^®) krävs.

Arbetsflöde:

Lagring

Denna produkt bör förvaras vid -25~-15 ℃ för 1 år.

Anteckningar

Om operationen

1. 1. Använd labbrockar och engångshandskar, för din säkerhet.
2. Tina komponenterna i rumstemperatur.Efter upptining, blanda noggrant genom att vortexa, snurra röret kort och lägg dem på is för senare användning.
3. Det rekommenderas att utföra varje reaktionssteg i en termocykler med uppvärmt lock. Termocyklern bör förvärmas till inställd temperatur före användning.
4. Använd förbrukningsvaror utan RNasekontaminering och rengöring av försöksområdet regelbundet. ThermoFishers RNAZap^TM Spray för borttagning av nukleinsyra med hög effektivitet rekommenderades för att avlägsna RNas-kontamination.
5. Felaktiga åtgärder kan med stor sannolikhet orsaka aerosolkontamination, vilket påverkar resultatets noggrannhet.Obligatorisk fysisk isolering av PCR-reaktionsblandningsregioner och PCR-produktreningsanalysregioner rekommenderas. Utrustad med utrustning som specialiserade pipetter för biblioteksbyggande.
6. 6. Denna produkt är endast avsedd för forskning.

Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kit och kort Adapter kit finns tillgängliga för kunderna att välja enligt deras experimentella krav.
2. Att välja kommersiella adaptrar av hög kvalitet rekommenderades. Om egentillverkade adaptrar väljs, anförtro ett företag med erfarenhet av NGS-primersyntes och påpeka behovet av strikt kontamineringskontroll. Dessutom rekommenderas att förbereda DNA-glödgningslösning på en ren bänk och endast använda en typ av adapter varje gång för att förhindra korskontaminering.
3. Tina adaptrarna på isen eller vid 4°C; vid drift i rumstemperatur bör laboratorietemperaturen inte överstiga 25°C för att förhindra att adaptrarna denatureras.
4. Koncentrationen av adaptern påverkar direkt ligeringseffektiviteten och biblioteksutbytet. Adaptervolymen som läggs till satsen är fixerad till 5 μl. Adaptrarna rekommenderas att spädas med 0,1×TE-buffert och de utspädda adaptrarna kan förvaras vid 4°C i 48 timmar. Tabell1 listar den rekommenderade adaptermängden för olika mängder ingående RNA.

Tabell 1-1 Rekommenderad Illumina^® adaptermängd för olika ingångar DNA&RNA

Tabell 1-2 Den rekommenderade MGI^® adaptermängd för olika ingångar DNA&RNA

*Användningen av adaptern kan justeras efter olika typer av totala RNA-prover och inmatad mängd.

Biblioteksförstärkning

Antalet amplifieringscykel bör vara strikt kontrollerade. Otillräcklig amplifiering kan leda till lågt biblioteksutbyte; Överförstärkning kan introducera ökad bias, fel, duplicerad läsning och chimära produkter. Tabell 2 listar rekommenderade cykelnummer som är inriktade på biblioteksutbytet på 1 μg.

Tabell 2 Det rekommenderade antalet cykler för att generera DNA- och RNA-bibliotek *

Obs:*Bibliotekets utbyte är inte bara relaterat till ingångskvantiteten och antalet amplifieringscykler, utan påverkas också av kvaliteten på prover, fragmenteringsförhållanden och sorteringsförhållanden. I processen med biblioteksbyggandet, välj de lämpligaste förhållandena enligt den faktiska situationen.

Pärlbaserad DNA-rensning och storleksval

1. 1. Det finns flera steg i bibliotekskonstruktionsprocessen som kräver DNA-rening av magnetiska pärlor. Vi rekommenderar Hieff NGS™ DNA-selektionspärlor (Yeasen Cat#12601) eller AMPure® XP magnetiska pärlor (Beckman Cat#A63880) för DNA-rening och storleksval.
2. 2. De magnetiska pärlorna bör utjämnas vid rumstemperatur före användning, annars kommer utbytet att minska och storleksvalseffekten påverkas.
3. 3. De magnetiska pärlorna ska blandas väl genom virvel eller pipettering före användning.
4. 4. Aspirera inte pärlorna när du överför supernatanten, även spårmängder av pärlorna kan påverka följande reaktioner.
5. 5. Etanolen på 80 % bör vara nyberedd, annars kommer det att påverka återvinningseffektiviteten.
6. 6. De magnetiska pärlorna bör torkas i rumstemperatur innan produkten elueras. Otillräcklig torrhet leder lätt till att etanolrester påverkar efterföljande reaktioner; överdriven torrhet gör att de magnetiska pärlorna spricker och minskar reningsutbytet. Normalt räcker det att torka i rumstemperatur i 3-5 minuter för att pärlorna ska torka helt.
7. 7. Vid behov eluerades de renade eller storleksvalda DNA-proverna in1× TE-buffert kan förvaras vid 4°C i 1-2 veckor eller vid -20°C i en månad.

Bibliotekskvalitetsanalys

1. Kvaliteten på de konstruerade biblioteken analyseras i allmänhet genom att mäta koncentrationer och storleksfördelningar.
2. Bibliotekens koncentrationer kan mätas med fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen eller qPCR.
3. Det rekommenderas INTE att använda absorbansbaserade kvantifieringsmetoder som NanoDrop.
4. Det rekommenderas att använda qPCR-metoden för bibliotekskvantifiering: fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen kan inte skilja de ofullständiga dsDNA-strukturerna (inserts utan adapter eller med endast en av ändarna ligerad med adapter) från de kompletta biblioteken. qPCR-metoden kommer endast att amplifiera och mäta de kompletta biblioteken med båda ändarna ligerade med adaptrar (de sekvenserbara biblioteken), vilket ger en mer exakt mätning för laddning.
5. Storleksfördelningen av bibliotek kan analyseras med hjälp av Agilent Bioanalyzer eller andra enheter baserade på principerna för kapillärelektrofores eller mikrofluidik.

Andra material

1. 1. Magnetiska pärlor för DNA-rening: Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^®XP Beads (A63880) eller andra likvärdiga produkter.

2.Adaptrar: Komplett adapter för Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 eller andra likvärdiga produkter) eller Komplett Adapter för MGI (Yeasen Cat#13360-13362 eller andra likvärdiga produkter).

3. Bibliotekskvalitetsanalys: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andra likvärdiga produkter; bibliotekets kvantitativa reagens.
4. Andra material: absolut etanol, sterilt ultrarent vatten, pipettspetsar med låg retention, PCR-rör, magnetstativ, termocykler, etc.

Dokument:

Manualer

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf