Beskrivning
Produktbeskrivning
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit är ett komplett RNA-sekvenseringsbiblioteksbyggsats för Illumina®- och MGI®-sekvenseringsplattformen, inklusive RNA-fragmenteringsreagens, omvänd transkriptionsreagens, konventionella och strängspecifika ds-cDNA-syntesreagenser och amplifieringsreagenser för bibliotek. Sekvenseringsbiblioteket kan konstrueras följt av mRNA-reningssatsen eller rRNA-borttagningssatsen. Tvåsträngssyntesmodulen är utrustad med två buffertar för att möta behovet av ett konventionellt bibliotek eller strängspecifikt bibliotek. Bland dem ersätts dTTP med dUTP i den strängspecifika tvåsträngssyntesbufferten, så dUTP kan läggas till den andra strängen av cDNA. Det högtrogna DNA-polymeraset som används i detta kit kan inte amplifiera DNA-mallen som innehåller uracil, vilket uppnår strängspecificitet. Alla tillhandahållna reagenser har genomgått strikt kvalitetskontroll och funktionsverifiering, vilket säkerställer stabiliteten och reproducerbarheten av bibliotekskonstruktionen i största utsträckning.
Arbetsflöde
Produktkomponenter
| Komponenter | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | 2× Frag/Prime Buffer | 250 μL | 930 μL | ||
| 12308-B | 1st Strand Enzyme Mix | 48 μL | 192 μL | ||
| 12308-C | Strängspecificitetsreagens | 150 μL | 580 μL | ||
| 12308-D | 2nd Strand Buffer (dNTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-E | 2nd Strand Buffer (dUTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | 2nd Strand Enzyme Master Mix | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-G | Ligation Enhancer | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-H | Nytt T4 DNA-ligas | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-I | 2×Super Canace® II High-Fidelity Mix | 600 μL | 2×1200 μL | ||
| 12308-K | Nukleasfritt H2O | 300 μL | 1000 μL | ||
Obs: Detta kit är kompatibelt med både Illumina- och MGI-plattformar, men ytterligare Illumina eller MGI Primer Mix ( Cat # 13335 Primer Mix för Illumina och Cat# 13334 Primer Mix för MGI ) är nödvändig.
Frakt och förvaring
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit-komponenter i box I levereras med isförpackningar och kan förvaras vid 2-8°C i ett år.
Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit-komponenter i Box II levereras med torris och kan förvaras vid -20°C i ett år.
Varningar
1 Drift
1.1 För din säkerhet och hälsa, använd personlig skyddsutrustning (PPE), såsom laboratorierockar och engångshandskar, när du använder denna produkt. Denna produkt är ENDAST för forskningsanvändning!
1.2 Tina komponenter i rumstemperatur. Blanda noggrant genom att vända upp och ner flera gånger, snurra ner kort och lägg på is för användning.
1.3 Det rekommenderas att utföra varje stegsreaktion i en termocykler med ett uppvärmt lock. Termocyklern bör förvärmas till den inställda temperaturen före användning.
1.4 Tillförsel fria från RNase-kontamination och rengöring av experimentområdet regelbundet är nödvändigt.
1.5 Felaktiga åtgärder kan med stor sannolikhet orsaka aerosolkontamination, vilket påverkar resultatets noggrannhet. Obligatorisk fysisk isolering av PCR-reaktionsblandningsregioner och PCR-produktreningsanalysregioner rekommenderas. Utrustad med utrustning som specialiserade pipetter för biblioteksbyggande.
2 Adapter Ligation
2.1 Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kit och korta Adapter kit finns tillgängliga för kunder att välja mellan enligt deras experimentella krav.
2.2 Att välja kommersiella adaptrar av hög kvalitet rekommenderades. Om egentillverkade adaptrar väljs, anförtro ett företag med erfarenhet av NGS-primersyntes och anmärk på behovet av strikt kontamineringskontroll. Dessutom rekommenderas att förbereda DNA-glödgningslösning på en ren bänk och endast använda en typ av adapter varje gång för att förhindra korskontaminering.
2.3 Vänligen tina adaptrarna på isen eller vid 4°C; vid drift i rumstemperatur bör laboratorietemperaturen inte överstiga 25°C för att förhindra att adaptrarna denatureras.
2.4 Koncentrationen av adaptern påverkar direkt ligeringseffektiviteten och biblioteksutbytet. Adaptervolymen som läggs till satsen är fixerad till 5 μl. Adaptrarna rekommenderas att spädas med 0,1×TE-buffert och de utspädda adaptrarna kan förvaras vid 4°C i 48 timmar. Tabell 1 listar den rekommenderade adaptermängden för olika mängder ingående RNA.
Tabell 1-1 Den rekommenderade mängden Illumina-adapter för olika ingående RNA
| Indata totalt RNA | Illumina Adapterstamkoncentration |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥1 μg | 5 μM |
Tabell 1-2 Den rekommenderade MGI®-adaptermängden för olika ingående RNA
| Indata totalt RNA | MGI Adapterstamkoncentration |
| 100-499 ng | 2 μM |
| 500-4000 ng | 5 μM |
*Användningen av adaptern kan justeras efter olika typer av totala RNA-prover och inmatad mängd.
3 Biblioteksförstärkning
3.1 På basis av den första generationens DNA-polymeras har högtrogen DNA-polymeraset i kitet avsevärt förbättrat sin amplifieringslikformighet och uppvisar ingen amplifieringsbias.
3.2 Om Indexerad Adapter (även känd som en lång adapter eller stor Y-adapter) ligeras till mål-DNA:n, kan primerblandningen som tillhandahålls i detta kit användas för amplifiering; om en "kort adapter" eller "liten Y-adapter" används för DNA-ligering, behövs indexprimrar för amplifiering.
3.3 Antalet amplifieringscykel bör vara strikt kontrollerade. Otillräcklig amplifiering kan leda till lågt biblioteksutbyte; Överamplifiering kan introducera ökad bias, fel, duplicerad läsning, chimära produkter och ackumulering av expansionsmutationer. Tabell 2 listar de rekommenderade cykelnumren för PCR-amplifiering.
Tabell 2 Det rekommenderade antalet cykler för att generera RNA-bibliotek*
| Indata totalt RNA | Antal cykler | |
| Icke-strandad | Strandsatt | |
| 10 ng | 15 | 15 |
| 100 ng | 14 | 14 |
| 500 ng | 12 | 13 |
| 1 μg | 11 | 12 |
Notera:*Bibliotekets utbyte är inte bara relaterat till ingångskvantiteten och antalet förstärkningscykler men påverkas också av provernas kvalitet, fragmenteringsförhållanden och sorteringsförhållanden. I processen med biblioteksbyggandet, välj de lämpligaste förhållandena enligt den faktiska situationen.
4 Pärlbaserad DNA-rensning och storleksval
4.1 Det finns flera steg i bibliotekskonstruktionsprocessen som kräver DNA-rening magnetiska pärlor. Vi rekommenderar Hieff NGS™ DNA-selektionspärlor (Yeasen Cat#12601) eller AMPure® XP magnetiska pärlor (Beckman Cat#A63880) för DNA-rening och storleksval.
4.2 De magnetiska pärlorna bör utjämnas vid rumstemperatur före användning, annars kommer utbytet att minska och storleksvalseffekten påverkas.
4.3 De magnetiska pärlorna ska blandas väl genom virvel eller pipettering före användning.
4.4 Aspirera inte pärlorna när du överför supernatanten, även spårmängder av pärlorna kan påverka följande reaktioner.
4.5 Etanolen på 80 % bör vara nyberedd, annars kommer det att påverka återvinningseffektiviteten.
4.6 De magnetiska pärlorna bör torkas i rumstemperatur innan produkten elueras. Otillräcklig torrhet leder lätt till att etanolrester påverkar efterföljande reaktioner; överdriven torrhet gör att de magnetiska pärlorna spricker och minskar reningsutbytet. Normalt räcker det att torka i rumstemperatur i 3-5 minuter för att pärlorna ska torka helt.
4.7 Vid behov kan de renade eller storleksutvalda DNA-proverna eluerade i TE-buffert förvaras vid 4°C i 1-2 veckor eller vid -20°C i en månad.
5 Bibliotekskvalitetsanalys
5.1 Normalt kan kvaliteten på det konstruerade biblioteket utvärderas genom längdfördelning och koncentrationsdetektion.
5.2 Detektering av bibliotekskoncentration: metoder baserade på dubbelsträngat DNA-fluorescerande färgämnen, såsom Qubit®, PicoGreen®, etc.; absolut kvantifiering baserad på qPCR.
5.3 Metoder baserade på spektral detektion, såsom NanoDrop®, etc., är inte tillämpliga på detektering av bibliotekskoncentration.
5.4 qPCR rekommenderas för detektion av bibliotekskoncentration: Genom Qubit®, PicoGreen® och andra metoder baserade på dubbelsträngade DNA-fluorescerande färgämnen kan den inte effektivt skilja mellan produkter som är ligerade till adaptrar i ena änden, produkter som inte är ligerade till adaptrar i båda ändar och andra ofullständiga dubbelsträngade produkter. Absolut kvantifiering av qPCR är baserad på principen om PCR-amplifiering, som endast kvantifierar det fullständiga biblioteket av adaptern i båda ändarna av provet (biblioteket som kan sekvenseras), exklusive interferensen av icke-sekvenserande bibliotek som inte är ligerade till adaptern vid antingen enkeländade eller dubbeländade ändar.
5.5 Detektering av bibliotekslängddistribution kan utföras av Agilent Bioanalyzer 2100 och annan utrustning baserad på principen om kapillärelektrofores eller mikrofluidik.
Dokument:
12308ES-Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit-Ver.EN20230327.pdf
Citat och referenser:
[1] Dechiffrera tarmmikrobiomet hos gräskarp genom multi-omics-metod
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou... - Microbiome, 2024 IF:19.4
[2] Poolad CRISPR-screening identifierar P-kroppar som repressorer av cancer epitelial-mesenkymal övergång
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang... - Cancerforskning, 2024 IF:12.7
[3] Klotho-härledd peptid 1 hämmar cellulär senescens i den fibrotiska njuren genom att återställa Klotho-uttryck via posttranskriptionell reglering
X Zhang, L Li, H Tan, X Hong, Q Yuan, FF Hou… - Theranostics, 2024 IF:12.4
[4] Exoskelett partiellt belagda stamceller för återställande av infarkt myokardium
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu... - Avancerat material, 2023 IF: 29.4
[5] Genomisk innovation och regulatorisk omkoppling under utvecklingen av bomullssläktet Gossypium
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang... - Nature Genetics, 2022 IF:41.379
[6] MTMR3-riskalleler förbättrar Toll Like Receptor 9-inducerad IgA-immunitet vid IgA-nefropati
Y Wang, T Gan, S Qu, L Xu, Y Hu, L Liu, S Shi, J Lv... - Kidney International, 2023 IF:19.6
[7] Delat komplement till basredigerare för att minimera redigeringar utanför målet
X Xiong, K Liu, Z Li, FN Xia, XM Ruan, X He, JF Li - Nature Plants, 2023 IF:18.6
[8] Konstruerade bakteriella yttre membranvesiklar som kapslar in onkolytiska adenovirus förbättrar effektiviteten av cancerviroterapi genom att förstärka tumörcellsautofagi
W Ban, M Sun, H Huang, W Huang, S Pan... - Nature Communications, 2023 IF:16.6
[9] Cancercellsresistens mot IFNγ kan uppstå via förbättrad dubbelsträngs brottreparationsaktivitet
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Cancer Immunology Research, 2023 IF: 12.0
[10] Kombinationsterapi baserad på biomimetiskt nanoleveranssystem med dubbla mål för att övervinna cisplatinresistens vid hepatocellulärt karcinom
Y Huang, Q Kou, Y Su, L Lu, X Li, H Jiang… - Journal of Nanobiotechnology, 2023 IF: 10.9
[11] PIAS3 främjar ferroptos genom att reglera TXNIP via TGF-β-signalvägen i hepatocellulärt karcinom
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Farmakologisk forskning, 2023 IF:9.3
[12] Identifiering av RNA-bindande proteinmål med HyperTRIBE i Saccharomyces cerevisiae
W Piao, C Li, P Sun, M Yang, Y Ding, W Song... - International Journal of Molecular Science, 2023 IF:5.6
[13] Mikrobiota reglerar livscykelövergång och nematocytdynamik hos maneter
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao... - Iscience, 2023 IF: 5.08
[14] Transkriptom- och miRNA-profiler avslöjar regulatoriskt nätverk och nyckelregulatorer för sekundär xylembildning i "84K" poppel
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - International Journal of Molecular Science, 2023 IF:5.6
Betalning och säkerhet
Din betalningsinformation behandlas säkert. Vi lagrar inte kreditkortsuppgifter och har inte heller tillgång till din kreditkortsinformation.
Förfrågan
Du kanske också gillar
Vanliga frågor
Produkten är endast avsedd för forskningsändamål och är inte avsedd för terapeutisk eller diagnostisk användning hos människor eller djur. Produkter och innehåll skyddas av patent, varumärken och upphovsrätt som ägs av Yeasen Biotechnology. Varumärkessymboler anger ursprungsland, inte nödvändigtvis registrering i alla regioner.
Vissa applikationer kan kräva ytterligare immateriella rättigheter från tredje part.
Yeasen är dedikerad till etisk vetenskap, och anser att vår forskning bör behandla kritiska frågor samtidigt som den säkerställer säkerhet och etiska standarder.