Hieff NGS^TM DNA Library Prep Kit är en ny generations biblioteksbyggsats speciellt utvecklad och designad för Illumina® &MGI® sekvenseringsplattform. På basis av den tidigare generationens biblioteksbyggsats uppvisar denna produkt högre effektivitet i slutreparation, dA-tailing och adapterligering än de tidigare versionerna. High-fidelity-enzymet förbättrar avsevärt likformigheten och troheten i amplifieringen. Satsen är kompatibel med de flesta DNA-provtyper, inklusive standard genomiskt DNA från djur/växter/mikroorganismer, FFPE-prover, cfDNA och ChIP-DNA.

Specifikationer

Komponenter

Lagring

Denna produkt bör förvaras vid -25~-15 ℃ för 1 år.

Anteckningar

1. Om operationen

1. Använd labbrockar och engångshandskar, för din säkerhet.

2. Tina komponenterna i rumstemperatur. Efter upptining, blanda noggrant genom att vortexa, snurra röret kort och lägg dem på is för senare användning.

3. När du förbereder reaktionslösningen för varje steg, rekommenderas det att använda en pipett för att blanda väl eller skaka försiktigt. Kraftig skakning kan orsaka en minskning av bibliotekets utdata.

4. Det rekommenderas starkt att använda filtrerade pipettspetsar för att undvika korskontaminering. Se till att byta pipettspetsar när du bearbetar olika prover.

5. Felaktiga åtgärder kan med stor sannolikhet orsaka aerosolkontamination, vilket påverkar resultatets noggrannhet. Obligatorisk fysisk isolering av PCR-reaktionsblandningsregioner och PCR-produktreningsanalysregioner rekommenderas. Utrustad med utrustning som specialiserade pipetter för biblioteksbyggande.Utför rutinmässig rengöring för varje område genom att torka av ytorna med 0,5 % natriumhypoklorit eller 10 % blekmedel

6. Denna produkt är endast avsedd för forskning.

2. DNA-fragmentering

1. Detta kit är kompatibelt med antingen mekaniskt fragmenterat DNA eller enzymatiskt fragmenterat DNA.

2. Satsen är kompatibel med 100 pg - 1000 ng ingående DNA. Det rekommenderas starkt att använda ingående DNA av hög kvalitet med A260/A280 = 1,8-2,0. Tabell 1 listar den rekommenderade mängden inmatat DNA.

Tabell 1 Rekommenderad mängd inmatat DNA

Notera: När inmatat DNA är av dålig kvalitet eller val av DNA-storlek krävs, bör mängden inmatat DNA ökas i enlighet med detta.

3."Input DNA" hänvisar specifikt till DNA-proverna redo för slutreparation/dA-svansning.

4. Ett steg för rening av pärlor/storleksval rekommenderas efter fragmentering om det ingående DNA-provet innehåller höga koncentrationer av salter som metallkelatbildaren. Salterna kan påverka effektiviteten av följande reaktioner, inklusive slutreparation och dA-tailing. Eluera DNA-proverna i TE-buffert istället för steriliserat ultrarent vatten för fragmentering om du använder den mekaniska fragmenteringsmetoden. Om du använder den enzymatiska fragmenteringsmetoden utan att utföra rensning av pärlor eller storleksval innan du fortsätter till biblioteksberedningen, se till att stoppbufferten som används inte innehåller mer än metallkelatbildande medel. Annars, vänligen städa upp eller storleksvälj de fragmenterade proverna och eluera dem i TE-buffert eller steriliserat ultrarent vatten (≤50 μL) innan du fortsätter till biblioteksberedning.

3. Adapter Ligation

1. Illumina eller MGI Long Adapter (Barcoded Adapter) kit och kort Adapter kit finns tillgängliga för kunderna att välja enligt deras experimentella krav.

2. Att välja kommersiella adaptrar av hög kvalitet rekommenderades. Om egentillverkade adaptrar väljs, anförtro ett företag med erfarenhet av NGS-primersyntes och påpeka behovet av strikt kontamineringskontroll. Dessutom rekommenderas att förbereda DNA-glödgningslösning på en ren bänk och endast använda en typ av adapter varje gång för att förhindra korskontaminering.

3. Tina adaptrarna på isen eller vid 4°C; vid drift i rumstemperatur bör laboratorietemperaturen inte överstiga 25°C för att förhindra att adaptrarna denatureras.

4. Adaptrarnas kvalitet och koncentration kommer direkt att påverka ligeringseffektiviteten och biblioteksutbytet. För hög koncentration av adaptrar gynnar adapterdimerbildning medan för lite adapter minskar ligeringshastighet och biblioteksutbyte. Motsvarande spädningar med TE-buffert enligt ingående DNA-mängd vid användning av adapter. Tabell 2 -5 listar de rekommenderade adapterspädningsmetoderna för olika inmatade DNA-mängder med detta kit.

Tabell 2 Den rekommenderade Illumina^TM adaptermängd för olika ingångar DNA

Tabell 3 Den rekommenderade MGI^TM adaptermängd för olika ingångar DNA

Tabell 4 Den rekommenderade Illumina^TM UMI adaptermängd för olika ingångar DNA

Tabell 5 Den rekommenderade MGI^TM UMI adapter amcount för olika input DNA

4. Pärlbaserad DNA-rensning och storleksval

1. DNA-storleksval kan utföras före ändreparation/dA-svansning, efter adapterligering eller efter amplifiering.

2. Det rekommenderas att utföra storleksval direkt efter adapterligering om den ingående DNA-mängden är mer än 50 ng; Utför annars storleksval efter förstärkning.

3. Ligation Enhancer innehåller en hög koncentration av PEG, vilket kan ha en betydande inverkan på exakt storleksval. Således, om storleksval ska utföras direkt efter adapterligering, rekommenderas det starkt att lägga till ett pärlorrensningssteg före storleksvalet. Storleksvalssteget kan utföras direkt om det utförs före slutreparationen/dA-svansningen eller efter biblioteksförstärkningen.

4. De magnetiska pärlorna bör utjämnas vid rumstemperatur före användning, annars kommer utbytet att minska och storleksvalseffekten påverkas.

5. De magnetiska pärlorna ska blandas väl genom virvel eller pipettering före användning.

6. Aspirera inte pärlorna när du överför supernatanten, även spårmängder av pärlorna kan påverka följande reaktioner.

7. Etanolen på 80 % bör vara nyberedd, annars kommer det att påverka återvinningseffektiviteten.

8. För korrekt storleksval rekommenderas att börja med en volym på mer än 100 μL. Om mindre, rekommenderas det att höja volymen till 100 μL med ultrarent vatten.

9. De magnetiska pärlorna bör torkas i rumstemperatur innan produkten elueras. Otillräcklig torrhet leder lätt till att etanolrester påverkar efterföljande reaktioner; överdriven torrhet gör att de magnetiska pärlorna spricker och minskar reningsutbytet. Normalt räcker det att torka i rumstemperatur i 3-5 minuter för att pärlorna ska torka helt.

10. Vid behov eluerades de renade eller storleksvalda DNA-proverna in 0,1× TE-buffert kan förvaras vid 4°C i 1-2 veckor eller vid -20°C i en månad.

5. Biblioteksförstärkning

1. Huruvida biblioteksamplifiering ska utföras eller inte beror på mängden DNA-inmatning, typer av adaptrar, sekvenseringsdataapplikationerna, etc. Amplifieringssteget krävs om man använder partiella adaptrar. Vid användning av fullängdsadaptrar, om inmatat DNA<200 ng, rekommenderas att utföra amplifiering; annars är förstärkning inte nödvändig.

2. Antalet amplifieringscykel bör vara strikt kontrollerade. Otillräcklig amplifiering kan leda till lågt biblioteksutbyte; Överförstärkning kan introducera ökad bias, fel, duplicerad läsning och chimära produkter. Tabell 6 listar rekommenderade cykelnummer som är inriktade på biblioteksutbytet på 1 μg.

Tabell 6 Det rekommenderade antalet cykler att generera 1 000 ng biblioteksutbyte

Notera:

1.Tabell 6 visar antalet loopparametrar med högkvalitativa Input DNA-tester på cirka 200 bp. FFPE DNA-kvaliteten varierar mycket, och när DNA-kvaliteten är dålig eller bibliotekslängden är lång måste antalet cykler ökas på lämpligt sätt för att få tillräckligt med bibliotek.

2.jagOm storleksval krävs under biblioteksbyggandet rekommenderas ett högre cykelnummer för biblioteksförstärkning; annars rekommenderas lägre cykelnummer.

3.jagOm ofullständiga adaptrar används måste minst 2 cykler förstärkas för att bilda en komplett adapter.

6. Bibliotekskvalitetsanalys

1. Kvaliteten på de konstruerade biblioteken analyseras i allmänhet genom att mäta koncentrationer och storleksfördelningar.

2. Bibliotek'koncentrationer kan mätas med fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen eller qPCR.

3.Det rekommenderas INTE att använda absorbansbaserade kvantifieringsmetoder som NanoDrop.

4. Det rekommenderas att använda qPCR-metoden för bibliotekskvantifiering: fluorescensbaserade metoder som Qubit och PicoGreen kan inte skilja de ofullständiga dsDNA-strukturerna (inserts utan adapter eller med endast en av ändarna ligerad med adapter) från de kompletta biblioteken. qPCR-metoden kommer endast att amplifiera och mäta de kompletta biblioteken med båda ändarna ligerade med adaptrar (de sekvenserbara biblioteken), vilket ger en mer exakt mätning för laddning.

5. Storleksfördelningen av bibliotek kan analyseras med hjälp av Agilent Bioanalyzer eller andra enheter baserade på principerna för kapillärelektrofores eller mikrofluidik.

7. Andra material

1. DNA-rening magnetiska pärlor: Hieff NGS^TM DNA-selektionspärlor (Yeasen Cat#12601) eller AMPure^® XP Beads (A63880) eller andra likvärdiga produkter.

2. Adaptrar: Komplett adapter för Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Dual CDI Primers: Yeasen Katt#12412~Katt#12413; 384 Unique Dual Index (UDI) Primers: Yeasen Katt #12312~Katt #12315; UMI UDI-adaptrar: Yeasen Katt#13370~Katt#13371; Komplett adapter för MGI: Yeasen Cat#13360-13362. DNA Primer Mix:Katt#12190 eller Katt#12191.

3. Bibliotekskvalitetsanalys: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip eller andra likvärdiga produkter; bibliotekets kvantitativa reagens.

4. Andra material: absolut etanol, sterilt ultrarent vatten, pipettspetsar med låg retention, PCR-rör, magnetstativ, termocykler, etc.

Instruktioner

Steg 1. Slutreparation/dA-Taling

1. Tina reagensen som nämns i tabell 7 . Vänd upp och ned för att blanda reagenserna noggrant och placera dem på is för senare användning.

2. Montera reagenserna enligt tabell 7 på is.

Tabell 7 End Repair/dA-Tailing reaktionssystem

3. Blanda försiktigt genom att pipettera eller skaka, Centrifugera kort för att få ner lösningen.

4. Placera röret i en termocykler och ställ in programmet enligt tabell 8 .

Tabell 8 End Repair/dA-Tailing reaktionsprogram

Steg 2. Adapter Ligation

1. Späd adaptern till lämplig koncentration enligt tabell 2-5.

2. Tina reagensen som nämns i tabell 9 . Vänd upp och ned för att blanda reagenserna noggrant och placera dem på is för senare användning.

3. Montera reagenserna enligt tabell 9 på is.

Tabell 9 Adapter Ligation reåtgärdssystem

Notera: *Ligation Enhancer är trögflytande. Vänligen blanda noggrant genom att vända eller vända och centrifugera kort före användning.

**Den ursprungliga koncentrationen av Illumina^TM adaptern för YEASE är 15 μM. Vänligen späd adaptern enligt den inmatade mängden och gör adapterns volym fixerad till 5 μL.

**Den ursprungliga koncentrationen av MGI^TM adapter för YEASE är 10 μM. Vänligen späd adaptern enligt den inmatade mängden och gör adapterns volym fixerad till 5 μL.

4. Blanda noggrant genom att försiktigt pipettera upp och ner och snurra ner en kort stund för att samla upp all vätska från rörets sidor.

5. Inkubera provet i en förvärmd termocykler som visas i tabell 10 och utför adapteranslutningsreaktionen.

Tabell 10 Adapter Ligation reaktionsprogram

Steg 3. Rengöring eller storleksval efter Adapter Ligation

Detta steg är att rena eller storleksvälja produkten i steg 2 med magnetiska pärlor. Reningen kan ta bort rester av adaptrar, adapterdimerer eller andra oanvändbara produkter.

Clean upp av Adapter-ligerat DNA

1. Förberedelser: ta Hieff NGS^TM DNA Selection Beads ut ur kylen och jämvikt i rumstemperatur i minst 30 minuter. Förbered 80% etanol färskt.

2. Blanda pärlorna noggrant genom att vända eller vända dem.

3. Tillägga 88 μL Hieff NGS^TM DNA-selektionspärlor (0.8×, pärlor: DNA = 0.8:1) till röret som innehåller den adapterligerade produkten, ställ och blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.

4. Centrifugera kort för att få ner lösningen och placera centrifugröret på det magnetiska stället. Efter att de magnetiska pärlorna är fullständigt adsorberade (ca 5 min), avlägsna försiktigt vätskan.

5. Håll röret på magnetstativet, tillsätt direkt 200 μL nyberedd 80% etanol till röret. Inkubera i rumstemperatur i 30 sekunder och ta försiktigt bort vätskan.

6. Upprepa steg 5 igen.

7. Behåll röret på magnetstativet, öppna locket och torka pärlorna tills pärlorna precis är spruckna (högst 5 minuter).

8. Ta bort röret från det magnetiska stativet för eluering och eluera DNA

1). Om produkten inte behöver väljas storlek, tillsätt 21 μL ddH₂O direkt. Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera upp och ner 10 gånger. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Snurra röret kort och placera det på magnetiskt stativ. När lösningen är klar (ca 5 min), överför 20 μL supernatant till ett nytt PCR-rör försiktigt utan att röra de magnetiska pärlorna.

2). Om produkten behöver väljas storlek, lägg till 102 μL ddH₂O direkt. Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera upp och ner 10 gånger. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Snurra röret kort och placera det på magnetiskt stativ. När lösningen är klar (cirka 5 min), överför 100 μL supernatant till ett nytt PCR-rör försiktigt utan att röra de magnetiska pärlorna.

Notera: Om den renade produkten behöver förvaras kan den elueras med TE Buffer.

Storleksval av adapterligerat DNA

1.Förberedelser: ta Hieff NGS^TM DNA Selection Beads ut ur kylen och jämvikt i rumstemperatur i minst 30 minuter. Förbered 80% etanol färskt.

2. Blanda pärlorna noggrant genom att vända eller vända dem.

3. Baserat på de riktade storlekarna, lägg till den första omgången av pärlor till de 100 μL renade DNA-mallarna enligt tabell 11. Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera 10 gånger.

Tabell 11 Rekommenderade pärlor: DNA-förhållanden för val av pärlor baserat på storlek

Notera: "×" i tabellen anger volymen av DNA-provet. Till exempel, om insättningslängden på biblioteket är 250 bp och provets DNA-volym är 100 μL, är volymen av magnetiska pärlor som används i den första sorteringsrundan 0,7×100 μL=70 μL; volymen av magnetiska pärlor som används i den andra sorteringsrundan är 0,20× 100 μL=20 μL. Den rekommenderade pärlvolymen i tabellen är för det adapterligerade DNA:t. Om storleksvalsproceduren utförs före ligering, se tillverkningsprotokollen för Hieff NGS^TM DNA-selektionspärlor (Katt#12601).

4. jagkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.

5. Snurra röret kort och placera det på ett magnetiskt stativ. När lösningen är klar (ca 5 min), överför supernatanten till ett nytt PCR-rör.

6. Lägg till den andra omgången av urvalspärlor till provet från steg 5 enligt tabell 11.Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera upp och ner minst 10 gånger.

7. jagkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.

8. Centrifugera kort för att få ner lösningen och placera centrifugröret på det magnetiska stället. Efter att de magnetiska pärlorna är fullständigt adsorberade (ca 5 min), avlägsna försiktigt vätskan.

9. Håll röret på magnetstativet, tillsätt direkt 200 μL nyberedd 80% etanol till röret. Inkubera i rumstemperatur i 30 sekunder och ta försiktigt bort vätskan.

10. Upprepa steg 9 igen.

11. Håll röret på magnetstativet, öppna locket och torka pärlorna tills pärlorna precis är spruckna (högst 5 minuter).

12. Ta bort röret från det magnetiska stativet för eluering, och direkt tillsätt 21 μL ddH₂O. Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettera upp-och-ned och inkubera i rumstemperatur i 5 minuter. (Obs: om du behöver förvara den renade produkten, vänligen eluera i TE-buffert.) Snurra kort ner röret och placera det på ett magnetiskt stativ tills vätskan blir klar (cirka 5 minuter). Överför försiktigt 20 μL supernatant till ett nytt PCR-rör utan att röra pärlorna.

Steg 4 Biblioteksförstärkning

Detta steg kan berika de renade eller storleksvalda produkterna genom PCR-amplifiering.

1. Tina reagenslistan i tabellen 12, vänd och blanda noggrant och lägg dem på is för senare användning.

2. Montera följande reaktion i ett steriliserat PCR-rör.

Tabell 12 adapterligerad DNA PCR-reaktion system

[Notera]: * om hela adaptern användes, Hieff NGS^TM Primer Mix (Yeasen Cat #12190 eller Cat#12191) i behov; Om en ofullständig adapter används (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Katt #12315, Cat#13370~Cat#13371), se satsens instruktioner och använd Index Primer som medföljer i satsen för amplifiering.

3. Blanda försiktigt genom att pipettera eller skaka och centrifugera kort för att få ner lösningen.

4. Lägg röret i en termocykler och ställ in programmet enligt tabellen 13 för att starta förstärkningen.

Tabell 13 PCR-amplifieringsreaktionsprogram

Steg 5 Rengöring efter förstärkning/storleksval

Det rena uppsteg hänvisar till steg 3. Hieff NGS^TM DNA-selektionspärlor (0,9x, pärlor:DNA=0,9:1) används för att rena PCR-produkten. Om storleksval behövs, se steg 3.

Steg 6 Kvalitetskontroll av de slutliga biblioteken

Kvaliteten på det konstruerade biblioteket utvärderas i allmänhet genom att mäta koncentrationen och storleksfördelningen. För detaljer, se anmärkning 6.