Hifair™ V Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus) är ett multiplex kvantitativt PCR-kit baserat på RNA som mall. Under experimentets gång utfördes omvänd transkription och kvantitativ PCR i samma rör, vilket förenklade den experimentella operationen och minskade risken för kontaminering.

I detta kit syntetiserades den första strängens cDNA effektivt av värmeresistent Hifair^TM V Omvänt transkriptas och kvantitativt amplifierad av UNICON^TM HotStart Taq DNA-polymeras. Satsen innehåller huvudsakligen optimerad MP-buffert, enzymblandning etc. Buffertlösningen innehåller redan Mg²⁺ och dNTP. Dessutom tillsätts de faktorer som effektivt kan hämma den icke-specifika PCR-amplifieringen och förbättra amplifieringseffektiviteten för flera qPCR-reaktioner, vilket kan säkerställa amplifieringseffektiviteten och utföra upp till multipla amplifieringsreaktioner. dUTP/UDG-systemet lades till för att effektivt förhindra risken för aerosolkontamination.

Drag

Hög känslighet:Det noggrant optimerade buffertsystemet förbättrar detektionskänsligheten för mallar med låg koncentration upp till 250 kopior/ml；

Superstabilitet: Produkten har klarat stabilitetstestning i realtid i 18 månader.

dUP/UDG anti-föroreningssystem:dUTP/UDG anti-föroreningssystem introduceras för att effektivt bryta ned aerosolföroreningar av produkter, minska falska positiva och säkerställa autentiska resultat；

Stöd snabbt program: kompatibelt med snabbt program, 40 min kan ge resultat;

Komponenter

Notera: 1) 2×Hifair^TM V MP-buffert är förkortningen av Hifair^TM V Multiplex One Step RT-qPCR-probbuffert, som inkluderar dNTP, dUTP, Mg2+, stabilisatorer, förstärkare och mer.

2) Hifair^TM V Enzymmix huvudsakligen innehåller värmetålig Hifair^TM V omvänt transkriptas, UNICONTM HotStart Taq DNA-polymerer och UDGase.

Lagring

Than produkt skall vara lagras på -25°C~-15°C för 18 månader.

Instruktioner

Reaktionssammansättning

Notera:Var noga med att blanda väl före användning, undvik överdrivna bubblor orsakade av våldsamma vibrationer.

a) Primer/Sond koncentration: Primer mix inklusive multiplex primer, beroende på situationen kan den optimala primerkoncentrationen vara mellan 0,1 och 1,0 μM.Sondblandning inklusive multiplex sondmärkning av skillnaden fluorescerande grupp, beroende på situationen kan den optimala sondkoncentrationen vara mellan 0,05 och 0.5 μM.

c) Mallutspädning: qPCR är mycket känslig och det rekommenderas att späda mallen. Kontroll Ct-värdet är lämpligt mellan 20 och 35.

d) Systemförberedelse: avhuvud med filterelement. Undvik korskontaminering och aerosolkontamination.

Optimerat cykelprotokoll

Notera:a) Romvänd transkription: Temperaturen kan välja 42°C eller 50°C i 10-15 minuter.

b) Amplifieringsreaktion: Temperaturen justeras enligt Tm-värdet för de designade primrarna.

c) Upptagning av fluorescenssignal: Ställ in den experimentella proceduren enligt kraven i instrumenthandboken.

3. Ansökan utrustning

Utrustning med Rox:ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™

Utrustning med Low Rox:ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 och 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Utrustning utan Rox:

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche tillämpad vetenskap LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Termo Vetenskaplig PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

Anteckningar

Vänligen använd nödvändig personlig skyddsutrustning, såsom labbrock och handskar, för att säkerställa din hälsa och säkerhet!

Använd RNase-fria förbrukningsvaror för experimentet.

Känslighetstest

De 13650 som förvarades vid -20°C i 18 månader (experimentgrupp) och de inom hållbarhetstiden (kontrollgruppen) testades samtidigt för gradientutspädningen (500 kopior/ml, 250 kopior/ml) av pseudovirus SARS-CoV-2, riktad mot ORF-genen och N-genen. Åtta replikatbrunnar testades för varje koncentration, med en detektionshastighet på 100 %. Dessutom fanns det inga signifikanta skillnader i amplifieringskurvans toppformer och Ct-värden.

Stabilitetstest i realtid

13650 förvaras vid -20°C i 18 månader och inom hållbarhetstid. Båda grupperna testades samtidigt för SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-genen och N-genen i en koncentration av 1000 kopior/ml med 20 replikatbrunnar. Detektionshastigheten för båda var 100 %, och det fanns inga signifikanta skillnader i formen på amplifieringskurvorna eller Ct-värdena.

Figur 1. Red: 13650 inom sin hållbarhetstid；blå:13650 förvaras vid -20°C i 18 månader.

Stabil prestanda efter upprepade frys-upptiningscykler

Genom att utsätta 13650-reagenset för 30 och 50 frys-upptiningscykler med torris, tillsammans med reagens som lagras normalt vid -20°C, och samtidigt testning för SARS-CoV-2 pseudovirus ORF-genen, visade resultaten att prestandan hos 13650-reagenset var opåverkad efter frysning av 50-cykeln.

Figur 2. Röd: 13650 lagrad normalt vid -20°C; Purpur:13650 till 30 frys-upptiningscykler；Grön:13650 till 50 frys-upptiningscykler.

Kompatibel med standard- och snabbprotokoll

Med användning av 13650ES detekterades ORF-genen och N-genen från SARS-CoV-2-pseudovirus under samma reaktionssystem med både standard- och snabbprotokoll. Resultaten visade att under ett 4-plexsystem fanns det ingen skillnad i amplifieringskurvans toppformer och Ct-värden mellan de två protokollen.

Dokument:

Manualer