Ospecifik amplifiering av Taq DNA-polymeras är ett vanligt problem i PCR-experiment, vilket direkt påverkar tolkningen av detektionsresultat och kan leda till en minskning av amplifieringskänsligheten och till och med en minskning av utbytet av målfragmentet. Att använda enzymmodifierare för att täta det aktiva centret av Taq DNA-polymeras vid rumstemperatur, och därigenom hämma DNA-polymerasaktiviteten av Taq-enzymet vid rumstemperatur, är för närvarande den mest effektiva metoden för att undertrycka ospecifik amplifiering. De dubbeltätande antikropparna som utvecklats av Yisheng förseglar inte bara polymerasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras utan förseglar samtidigt exonukleasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras. Detta dubbla tillvägagångssätt förhindrar effektivt ospecifik amplifiering orsakad av felparning eller primerdimerer och förhindrar även generering av ospecifika signaler på grund av materialnedbrytning, vilket förstärker reagensens specificitet dubbelt. Detta gör det möjligt för detektionsreagenser att klara transport eller rumstemperatur med lätthet.

1.Ultrahög amplifieringsspecificitet – Den dubbelförseglade antikroppen kan samtidigt försegla både polymeras- och exonukleasaktiviteter, vilket effektivt undviker ospecifik amplifiering och förbättrar specificiteten.

2.Exceptionell detektionskänslighet – varmstartsformuleringen säkerställer effektiv detektering av gener med låg förekomst, vilket ger högre känslighet.

3.Enastående produktstabilitet – Stabil i prestanda när den placeras vid 37°C i 5 dagar eller vid 4°C i 10 dagar.

4.Baslinjestabilitet och bra linjäritet – Löser problemet med baslinjedrift, vilket resulterar i utmärkt linjäritet.

5.Snabb frisättning av enzymaktivitet – Över 95 % av enzymaktiviteten kan frigöras genom uppvärmning vid 95°C i 20 sekunder.

6.Bred tillämpbarhet av enzymer – Lämplig för både vildtyps- och mutanta Taq-enzymer, med varje mg antikropp som kan täta 4-10 KU Taq-enzym.

1 Blockering av Taq DNA-polymeras exonukleasaktivitet

Syntetiska primerprober inkorporerades i reaktionsblandningarna av Taq DNA-polymeras som antingen var oförseglade eller förseglade med dubbelstängda antikroppar, och reaktionerna genomfördes vid 40°C. Fluorescenssignalerna för båda detekterades, och det visade sig att antikropparna med dubbel stängning effektivt kan försegla exonukleasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras.

Figur 2. Detektion av förseglingseffektiviteten för dubbelförseglad antikropp-endonukleasaktivitet.

02 Verifiering av detektionskänslighet

Genom att använda Yeasens dubbelförseglade antikropp respektive T Companys antikropp för att försegla Taq-enzym, följt av detektering av positiva prover genom ARMS-PCR-teknologi, fann man att Taq-enzymet förseglat av Yeasens dubbelförseglade antikropp var korrekt i ARMS-PCR-amplifiering med högre känslighet.

Röd:YEASEN antikropp+Taq; Blå:leverantör A antikropp+Taq.

Figur 3. Amplifieringskurva för ARMS-PCR.

03 Stabilitetsverifiering (4°C i 10 dagar, 37°C i 5 dagar).

Genom att använda traditionella slutna antikroppar och dubbelstängda antikroppar för att blockera Taq DNA-polymeras, formuleras sedan polymeraset till en komplett förblandningslösning innehållande primers och prober. Denna lösning lämnas vid 4°C i 10 dagar eller vid 37°C i 1, 3 och 5 dagar och används sedan för att amplifiera 10 000 kopior av ASF-plasmiden. Det observerades att det inte fanns några signifikanta förändringar i amplifieringskurvorna och Ct-värdena.

Figur 4. Amplifieringskurvor för 10 000 kopior av ASF-plasmid efter att Taq-polymeras blockerats med traditionell blockerande antikropp (A) och dubbelblockerad antikropp (B), amplifieras av systemet med qPCR.

04 Baslinjedetektering

Under vissa förhållanden där specifika primrar används tillsammans med särskilda buffertar och instrument, kan ett fenomen som kallas baslinjedrift inträffa. Användningen av dubbelstängda antikroppar kan dock effektivt lösa problemet med baslinjedrift och därigenom underlätta en mer stabil baslinje.

Figur 5. Amplifieringskurvor för SARS-CoV-2 N-genen (A) och ACT-genen (B) i qPCR-analys.

05 Linjäritetsverifiering

Reaktionsblandningen förseglad med dubbelstängda antikroppar användes för att amplifiera 100 000, 10 000, 1 000 och 100 kopior av ASFV/ACT-dubbelplasmiden för att generera en standardkurva. Som framgår av figur 7 uppvisar båda god linjäritet.

Figur 6. Standardkurvor för ASFV-genen och ACT-genen genererade med hjälp av en dubbelblocksreaktionsblandning.

06 Enzymatisk aktivitetsfrisättningsanalys

Genom att använda de dubbelstängda antikropparna (Cat #31303) från Yeasen för att försegla Taq-enzymet och utsätta det för en termisk chock vid 95°C under 20 sekunder, detekterades den enzymatiska aktiviteten. Det kan observeras att efter en 20-sekunders termisk chock vid 95°C kan 31303 frigöra mer än 95% av den enzymatiska aktiviteten, vilket är jämförbart med antikropparna från Company T.

Tabell 1. Värmechock vid 95°C under 20 sekunder av enzymet.

07 Multiplex Taq-polymerasdetektion

Yeasens dubbelstängda antikroppar (Cat#31303) användes för att försegla tre typer av Taq-polymeraser (vildtyp + två mutanttyper), med ett tätningsförhållande på 1μg till 5U, och fluorescensvärdena och förseglingseffektiviteten mättes. Det visade sig att för olika typer av Taq-polymeraser uppvisade Yeasens dubbelstängda antikroppar (Cat#31303) goda tätningseffekter.

Tabell 2. Blockerad effektivitet för olika typer av Taq-polymeras.