Beskrivning
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) är ett snabbt och mycket känsligt detektionskit baserat på WST-8-reagenset (2-(2-metoxi-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazoliummononatriumsalt). WST-8 är ett uppgraderat reagens av MTT och kan reduceras till ett mycket vattenlösligt orange-gult formazan genom dehydrogenaser i mitokondrierna. Mängden formazan som genereras är proportionell mot antalet levande celler. OD-värdet för formazan vid 450 nm detekterat av en mikroplattläsare kan indirekt indikera antalet livsdugliga celler. Detta kit används i stor utsträckning för läkemedelsscreening, cellproliferation och cytotoxicitetsanalyser, testning av tumörläkemedelskänslighet och aktivitetsdetektering av biologiska faktorer.
Fördelar med CCK-8-metoden
1. Jämförelse av CCK-8-metoden med andra metoder för detektion av cellproliferation/toxicitet.
| Detektionsmetod | MTT-metoden | XTT-metoden | WST - 1 metod | CCK 8-metoden |
|---|---|---|---|---|
| Formazanproduktens vattenlöslighet | Låg (måste tillsätta organiskt lösningsmedel för att lösa upp och sedan testa) | Hög | Hög | Hög |
| Produktens egenskaper | Pulver | 2 flaskor lösning | Lösning | 1 flaska lösning |
| Användningsmetod | Blanda till lösning och använd | Lösningen framställdes strax före användning. | Ur lådan | Ur lådan |
| Detektionskänslighet | Hög | Mycket hög | Mycket hög | Hög |
| Upptäckt tid | Lång | Kort | Kort | Den kortaste |
| Detektionsvåglängd | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| cytotoxicitet | Hög toxicitet, fullständigt försvinnande av cellmorfologi | Låg toxicitet, cellmorfologi oförändrad | Låg toxicitet, cellmorfologi oförändrad | Låg toxicitet, cellmorfologi oförändrad |
| Reagensstabilitet | Allmän | Låg | Allmän | Hög |
| Bulkprovstestning | Möjlig | Lämplig | Lämplig | Lämplig |
2. Fenolrött och serum stör inte CCK-8-detektion.
3. Eftersom cytotoxiciteten för CCK-8-reagens är mycket låg, kan den optimala mättiden bestämmas genom att upprepade gånger läsa av med en mikroplattläsare vid olika tidpunkter efter tillsats av CCK-8-reagens.
Frakt och förvaring
Produkten kunde förvaras vid -25~-15ºC på en torr och mörk plats i två år.
Försiktighetsåtgärder
1. I det första experimentet rekommenderas det att bestämma det optimala antalet pläterade celler och den optimala inkubationstiden för CCK-8-reagens.
2. Använd om möjligt en flerkanalspipett för att minska variationerna mellan replikatbrunnarna. Undvik bubblor i experimentet eftersom bubblor kommer att störa OD-avläsningen. När du tillsätter CCK-8-reagenset rekommenderas det att tillsätta det nära väggen på odlingsplattan istället för att föra in det i odlingsmediet.
3. Vita blodkroppar kan kräva en längre inkubationstid.
4. När du använder en standardplatta med 96 brunnar är antalet pläterade celler minst 1 000 celler/brunn (100 μL). Detektionskänsligheten för vita blodkroppar är relativt låg, så det rekommenderas att plåta minst 2 500 celler/brunn (100 μL). Om du använder en platta med 24 eller 6 brunnar, beräkna motsvarande antal celler för varje brunn och tillsätt lämplig volym CCK-8-reagens (volymen CCK-8-reagens som tillsätts är 10 % av volymen av odlingsmediet i varje brunn på plattan).
5.Om 450 nm-filtret inte är tillgängligt kan ett filter med absorbans mellan 430-490 nm användas, men 450 nm-filtret kan uppnå den högsta detektionskänsligheten.
6. Fenolrött påverkar inte mätningen eftersom absorbansen av fenolrött i mediet kan elimineras genom att subtrahera absorbansen för blankgruppen.
7. För din säkerhet och hälsa, vänligen bär labbrocken och engångshandskar när du utför experimentet.
Instruktioner
I. Gör en standardkurva
1. Förbered cellsuspensionen, bestäm celldensiteten och plåt sedan cellerna.
2. Späd cellerna sekventiellt med odlingsmediet enligt ett visst förhållande (såsom förhållandet 1:2) för att bilda en cellkoncentrationsgradient, vanligtvis 3-5 cellkoncentrationsgradienter, 3-6 replikatbrunnar för varje koncentration.
3. Efter utplätering, odla cellerna i 2-4 timmar för att få dem att fästa. Tillsätt sedan CCK-8-reagenset, inkubera under en viss tid och mät OD-värdet. Rita en standardkurva med cellnumret som X-axel och OD-värdet som Y-axel. Enligt denna standardkurva kan cellantalet i ett okänt prov bestämmas (förutsättningen för att använda denna standardkurva är att de experimentella förhållandena ska vara konsekventa).
II. Cellviabilitetsanalys
1. Platta celler (100 μL/brunn) i en 96-brunnars platta. Placera plattan i en inkubator (37°C, 5% CO2) under en tidsperiod för förinkubation.
2. Tillsätt 10 μL CCK-8-reagens till varje brunn (var noga med att inte införa bubblor i brunnarna, eftersom de stör OD-avläsningen) och blanda försiktigt.
3. Placera plattan i inkubatorn och inkubera i 1-4 timmar.
4. Mät absorbansen vid 450 nm med en mikroplattläsare.
5. Om OD-värdet inte mäts omedelbart, tillsätt 10 μL 0,1 M HCl-lösning eller 1 % w/v SDS-lösning till varje brunn, täck plattan och förvara den med skydd mot ljus i rumstemperatur. Absorbansvärdet kommer inte att ändras inom 24 timmar.
III. Cellproliferation och cytotoxicitetsanalys
1. Platta celler (100 μL/brunn) i en 96-brunnars platta. Placera plattan i en inkubator (37°C, 5% CO2) under 24 timmar för förinkubation.
2. Tillsätt 10 μL olika koncentrationer av ämnet som ska testas på plattan.
3. Placera plattan i inkubatorn och inkubera under en viss tid (som 6, 12, 24 eller 48 timmar).
4. Tillsätt 10 μL CCK-8-reagens till varje brunn (var noga med att inte införa bubblor i brunnarna, eftersom de stör OD-avläsningen) och blanda försiktigt.
5. Placera plattan i inkubatorn och inkubera i 1-4 timmar.
6. Mät absorbansen vid 450 nm med en mikroplattläsare.
7. Om OD-värdet inte mäts omedelbart, tillsätt 10 μL 0,1 M HCl-lösning eller 1 % w/v SDS-lösning till varje brunn, täck plattan och förvara den med skydd mot ljus i rumstemperatur. Absorbansvärdet kommer inte att ändras inom 24 timmar.
Notera: Om ämnet oxiderar eller reducerar, byt ut det gamla odlingsmediet med färskt medium (ta bort det gamla mediet, tvätta cellerna två gånger med färskt medium och tillsätt sedan färskt medium) innan du tillsätter CCK-8-reagenset för att eliminera effekten av ämnet.Om själva ämnet har bara a lätt effekt på absorbansvärdet finns det inget behov av att ersätta odlingsmediet och effekten av substansen kan elimineras genom att subtrahera absorptionsvärdet för en blank grupp med substansen.
Beräkningsformel
Cellöverlevnadsgrad =[(AC) /(BC)] x100 %
Hämningshastighet =[(BA) /(BC)] x100 %
S: Experimentgruppens absorbans (absorbansen hos odlingsmediet som innehåller celler, CCK-8-reagens och substansen som ska testas)
B: Kontrollgruppens absorbans (absorbansen av odlingsmediet som innehåller celler, CCK-8-reagens)
C: Absorbansen av blank grupp (absorbansen av odlingsmediet som innehåller CCK-8-reagens)
Citat
[1] Sun L, Li P, Ju X, et al. I vivo strukturell karakterisering av SARS-CoV-2 RNA-genomet identifierar värdproteiner som är sårbara för återanvända läkemedel. Cell. 2021;184(7):1865-1883.e20. doi:10.1016/j.cell.2021.02.008(IF:41.584)
[2] Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. GFAT1-kopplad TAB1-glutamylering upprätthåller p38 MAPK-aktivering och främjar lungcancercellöverlevnad under glukossvält. Cell Discov. 2022;8(1):77. Publicerad 2022 9 aug. doi:10.1038/s41421-022-00423-0(IF:38.079)
[3] Chen X, Zhang D, Su N, et al. Visualisera RNA-dynamik i levande celler med ljusa och stabila fluorescerande RNA. Nat Biotechnol. 2019;37(11):1287-1293. doi:10.1038/s41587-019-0249-1(IF:31.864)
[4] Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Ferroptos heterogenitet i trippelnegativ bröstcancer avslöjar en innovativ kombinationsstrategi för immunterapi [publicerad online i förväg, 11 oktober 2022]. Cell Metab. 2022;S1550-4131(22)00411-9. doi:10.1016/j.cmet.2022.09.021(IF:31.373)
[5] Rong QX, Wang F, Guo ZX, et al. GM-CSF förmedlar immunundandragande via uppreglering av PD-L1-uttryck i extranodala naturliga mördar-/T-cellslymfom. Mol Cancer. 2021;20(1):80. Publicerad 2021 29 maj. doi:10.1186/s12943-021-01374-y(IF:27.401)
[6] Xia B, Shen X, He Y, et al. SARS-CoV-2-höljeprotein orsakar akut andnödsyndrom (ARDS)-liknande patologiska skador och utgör ett antiviralt mål. Cell Res. 2021;31(8):847-860. doi:10.1038/s41422-021-00519-4(IF:25.617)
[7] Yang X, Zhao X, Zhu Y, et al. FBXO34 främjar latent HIV-1-aktivering genom post-transkriptionell modulering. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2785-2799. doi:10.1080/22221751.2022.2140605(IF:19.568)
[8] Zhou Z, Zhang X, Lei X, et al.Avkänning av cytoplasmatiskt kromatin av cGAS aktiverar medfödd immunsvar i SARS-CoV-2-infektion. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):382. Publicerad 2021 3 november. doi:10.1038/s41392-021-00800-3(IF:18.187)
[9] Li M, Hao B, Zhang M, et al. Melatonin förbättrar radiofrekvensinducerad NK-antitumörimmunitet, vilket orsakar omprogrammering av cancermetabolism och hämning av multipel lungtumörutveckling. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):330. Publicerad 2021 1 sep. doi:10.1038/s41392-021-00745-7(IF:18.187)
[10] Qi S, Zhu Y, Liu X, et al. WWC-proteiner förmedlar LATS1/2-aktivering av Hippo-kinaser och innebär en tumörundertryckningsstrategi. Mol Cell. 2022;82(10):1850-1864.e7. doi:10.1016/j.molcel.2022.03.027(IF:17.970)
[11] Zhu J, Li X, Cai X, et al. Argininmonometylering av PRMT7 kontrollerar MAVS-medierad antiviral medfödd immunitet. Mol Cell. 2021;81(15):3171-3186.e8. doi:10.1016/j.molcel.2021.06.004(IF:17.970)
[12] Teng KX, Niu LY, Xie N, Yang QZ. Supramolekylära fotodynamiska medel för samtidig oxidation av NADH och generering av superoxidradikal. Nat Commun. 2022;13(1):6179. Publicerad 2022 19 oktober. doi:10.1038/s41467-022-33924-3(IF:17.694)
[13] Zhong J, Guo Y, Lu S, et al. Rationell design av ett känslighetsförstärkt spårämne för att upptäcka effektiva APC-Asef-hämmare. Nat Commun. 2022;13(1):4961. Publicerad 2022 24 aug. doi:10.1038/s41467-022-32612-6(IF:17.694)
[14] Liu F, Wang X, Duan J, et al. En temporär PROTAC-cocktailmedierad sekventiell nedbrytning av AURKA upphäver stamceller från akut myeloid leukemi. Adv Sci (Weinh). 2022;9(22):e2104823. doi:10.1002/advs.202104823(IF:16.806)
[15] Ji C, Qiu M, Ruan H, et al. Transkriptomanalys avslöjade symbiosnischen hos 3D-ställningar för att påskynda läkning av bendefekter. Adv Sci (Weinh). 2022;9(8):e2105194. doi:10.1002/advs.202105194(IF:16.806)
[16] Feng L, Dou C, Xia Y, et al. Neutrofilliknande cellmembranbelagd nanozymterapi för ischemisk hjärnskada och långvarig neurologisk funktionell återhämtning. ACS Nano. 2021;15(2):2263-2280. doi:10.1021/acsnano.0c07973(IF:15.881)
[17] Wang Z, Gong X, Li J, et al. Syreavgivande polyfluorkolväte-nanovehicles förbättrar tumörsyresättningen och förstärker fotodynamiskt förmedlad antitumörimmunitet. ACS Nano. 2021;15(3):5405-5419. doi:10.1021/acsnano.1c00033(IF:15.881)
[18] Jiang Z, He L, Yu X, et al. Antiangiogenes i kombination med hämning av hypoxivägen underlättar lågdos, röntgeninducerad fotodynamisk terapi [publicerad online före tryckning, 2021 juni 25]. ACS Nano. 2021;10.1021/acsnano.1c01063. doi:10.1021/acsnano.1c01063(IF:15.881)
[19] Gong X, Li J, Xu X, et al. Mikrovesikelinspirerat syrelevererande nanosystem potentierar strålbehandlingsmedierad modulering av tumörstroma och antitumörimmunitet. Biomaterial. 2022;290:121855. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121855(IF:15.304)
[20] Deng J, Xu W, Lei S, et al. Rekrytering och mognad av aktiverade naturliga mördarceller beroende av dendritiska celler av responsiva nanogeler för inriktning på immunterapi mot pankreascancer. Små. 2022;18(44):e2203114. doi:10.1002/smll.202203114(IF:15.153)
Betalning och säkerhet
Din betalningsinformation behandlas säkert. Vi lagrar inte kreditkortsuppgifter och har inte heller tillgång till din kreditkortsinformation.
Förfrågan
Du kanske också gillar
Vanliga frågor
Produkten är endast avsedd för forskningsändamål och är inte avsedd för terapeutisk eller diagnostisk användning hos människor eller djur. Produkter och innehåll skyddas av patent, varumärken och upphovsrätt som ägs av Yeasen Biotechnology. Varumärkessymboler anger ursprungsland, inte nödvändigtvis registrering i alla regioner.
Vissa applikationer kan kräva ytterligare immateriella rättigheter från tredje part.
Yeasen är dedikerad till etisk vetenskap, och anser att vår forskning bör behandla kritiska frågor samtidigt som den säkerställer säkerhet och etiska standarder.