Annexin V-EGFP/PI-cellapoptosdetektionskit använder EGFP-märkt Annexin V som en sond för att upptäcka förekomsten av tidig cellapoptos.
Detektionsprincipen är följande: i normala levande celler finns fosfotidylserin (PS) på insidan av cellmembranet, men i tidiga apoptotiska celler vänder PS från insidan av cellmembranet till ytan av cellmembranet och exponeras för den extracellulära miljön. Annexin-V är en Ca²⁺ -beroende fosfolipidbindande protein med en molekylvikt på 35 till 36 kDa som binder till PS med hög affinitet. Fosfatidylserinet kan binda till membranet hos tidiga apoptotiska celler genom det exponerade fosfatidylserinet på utsidan av cellen.
Dessutom tillhandahålls propidiumjodid (PI) för att skilja överlevande tidiga celler från nekrotiska eller sena apoptotiska celler. PI är ett nukleinsyrafärgämne som inte kan passera genom det intakta cellmembranet hos normala celler eller tidiga apoptotiska celler utan kan passera genom cellmembranet hos sena apoptotiska och nekrotiska celler och göra kärnan röd. När Annexin V kombinerades med PI uteslöts PI från levande celler (Annexin V^-/PI^-) och tidiga apoptotiska celler (Annexin V⁺/PI^-). De sena apoptotiska och nekrotiska cellerna var dubbelpositiva för både EGFP och PI (Annexin V⁺/PI⁺).
Detta kit är lämpligt för flödescytometri och fluorescensmikroskopi.

Produktkomponenter

Frakt och förvaring

Komponenterna levereras med en ispåse och kan förvaras vid -20°C, skyddas mot ljus och undvik upprepad frysning och upptining i 1 år.
[Anmärkningar]: Om den behöver användas upprepade gånger under en kort period, kan den förvaras vid 4 ℃ och skyddas från ljus i ett halvår.

Varningar

1) Eftersom apoptos är en snabb process, rekommenderas att proverna analyseras inom 1 timme efter färgning.
2) För vidhäftande celler är matsmältningen ett kritiskt steg. Använd inte EDTA i matsmältningslösningen eftersom EDTA kan påverka bindningen av Annexin V till PS.
3) Annexin V-FITC, men inte Annexin V-EGFP, bör användas för att fixera celler, till exempel för att detektera apoptos och cellcykel samtidigt, eftersom EGFP skulle denatureras och förlora sin förmåga att excitera fluorescens under fixering. Celler inkuberades med Annexin V-FITC före fixering och obundet Annexin V-FITC tvättades bort med bindningsbuffert.Eftersom ökad cellpermeabilitet under fixering skapar cellrester som kan binda till Annexin V och störa resultaten.
4) Om provet är från blod, se till att ta bort blodplättar från blodet. Eftersom blodplättar innehåller PS, som kan binda till Annexin V, stör resultaten. Blodplättar kan tvättas bort genom att använda ett buffertmedel som innehåller EDTA och centrifugera vid 200 g.
5) Vänligen centrifugera reagenset kort innan du öppnar locket och kasta vätskan på lockets innervägg till botten av röret för att undvika vätskestänk när du öppnar locket.
6) Annexin V-EGFP och PI är ljuskänsliga ämnen, så undvik ljus under drift.
7) Endast för forskningsanvändning!

Instruktioner

Experimentdesign
Blankt rör: Negativa kontrollceller utan Annexin V-EGFP och PI-färgningslösning användes för spänningsreglering.
Enstaka färgade rör: Positiva kontrollceller, kompletterade endast med Annexin V-EGFP, användes för att modulera kompensation.
Detektionsrör: Cellerna behandlades med Annexin V-EGFP och PI-färgningslösning. De experimentella data erhölls genom att justera parametrarna för det tomma röret och enfärgningsröret.
1.1 Provfärgning
1) suspensionscell: Celler uppsamlades genom centrifugering vid 300 g under 5 minuter vid 4 ° C.
vidhäftande cell: Efter digestion med trypsin utan EDTA, skördades cellerna genom centrifugering vid 300 g under 5 minuter vid 4 ° C. Trypsin digestion tid bör inte vara för lång för att förhindra falska positiva.
2) Cellerna tvättades med förkyld PBS två gånger, varje gång vid 300 g, och centrifugerades vid 4 ℃ under 5 min.
3) Cellerna återsuspenderades med 1 x bindningsbuffert och koncentrationen justerades till 1~5 x 106/ml.
4) 100 μL cellsuspension tillsattes i 5 mL flödescytometrirör, 5 μl Annexin V-EGFP tillsattes och cellerna blandades och inkuberades i 5 minuter vid rumstemperatur under ljus.
5) Tillsats av 10 μl PI-lösning och 400 μl PBS, färgningen utfördes omedelbart.
[Anmärkningar]: När du använder flödescytometri för att detektera apoptos, påverkas PI kraftigt av tiden, och för lång tid kommer att leda till en ökning av PI-färgning, så flödescytometri bör slutföras inom 1 timme.
1.2 Flödescytometrianalys
Den maximala excitationsvåglängden för EGFP var 488 nm, och den maximala emissionsvåglängden var 507 nm; Den maximala excitationsvåglängden för PI-DNA-komplexet var 535 nm, och den maximala emissionsvåglängden var 615 nm. Programvara som CellQuest användes för analys och en tvåfärgad punktplot ritades, EGFP är abskissan och PI är ordinatan. Samla in 10 000 händelser per prov. I ett typiskt experiment kan cellerna delas in i tre undergrupper, levande celler har endast mycket lågintensiv bakgrundsfluorescens, tidiga apoptotiska celler har bara stark grön fluorescens och sena apoptotiska celler har grön och röd fluorescens dubbelfärgning.