Detektionsprincipen för Annexin V-Alexa Fluor488/PI apoptosdetektionskit är följande: i normala levande celler är fosfotidylserin (PS) lokaliserat på insidan av cellmembranet, men i tidiga apoptotiska celler vänder PS från insidan av cellmembranet till ytan av cellmembranet och är exponerade cellmembranet. Annexin-V är en Ca²⁺ -beroende fosfolipidbindande protein med en molekylvikt på 35 till 36KD, som binder med hög affinitet till PS och binder till cellmembranet hos tidiga apoptotiska celler genom fosfatidylserin exponerat på utsidan av cellen.
Dessutom tillhandahålls propidiumjodid (PI) för att skilja överlevande tidiga celler från nekrotiska eller sena apoptotiska celler. PI är ett nukleinsyrafärgämne som inte kan passera genom det intakta cellmembranet hos normala celler eller tidiga apoptotiska celler utan kan passera genom cellmembranet hos sena apoptotiska och nekrotiska celler och göra kärnan röd. När Annexin V kombinerades med PI uteslöts PI från levande celler (Annexin V^-/PI^-) och tidiga apoptotiska celler (Annexin V⁺/PI^-). Däremot var sena apoptotiska och nekrotiska celler dubbelpositiva för Alexa Fluor488 och PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Produktkomponenter

Frakt och förvaring

Komponenterna levereras med en ispåse och kan förvaras vid -20°C i 1 år.

Varningar

1) Eftersom apoptos är en snabb process, rekommenderas att proverna analyseras inom 1 timme efter färgning.
2) För vidhäftande celler är matsmältningen ett kritiskt steg. Använd inte EDTA i matsmältningslösningen eftersom EDTA kan påverka bindningen av Annexin V till PS.
3) Om provet är från blod, se till att ta bort blodplättar från blodet. Eftersom blodplättar innehåller PS, som kan binda till Annexin V, stör resultaten. Ett buffertmedel innehållande EDTA kan användas och blodplättarna tvättas bort genom centrifugering vid 200 g.
4) Vänligen centrifugera reagenset kort innan du öppnar locket och kasta vätskan på lockets innervägg till botten av röret för att undvika vätskestänk när du öppnar locket.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 och PI är ljuskänsliga ämnen och bör hållas borta från ljus vid hantering.
6) Endast för forskning!

Instruktioner

1.1 Provfärgning
1.a) suspensionscell: Celler uppsamlades genom centrifugering vid 300 g under 5 minuter vid 4°C.
b) vidhäftande cell: Efter digestion med trypsin utan EDTA skördades cellerna genom centrifugering vid 300 g under 5 minuter vid 4 °C. Trypsin matsmältningstiden bör inte vara för lång för att förhindra falska positiva.
2. Cellerna tvättades två gånger med PBS förkyld vid 4°C, varje gång med användning av 300 g, och centrifugerades vid 4°C under 5 min.
3. Cellerna återsuspenderades genom att tillsätta 250 μL 1×bindande buffert och koncentrationen justerades till 1×106/ml.
4. 100 μL cellsuspension tillsattes i ett 5 mL flödescytometrirör, 5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488 och 10 μL PI tillsattes och blandades försiktigt.
5. Reaktionen hölls borta från ljus och hölls vid rumstemperatur under 15 min.
6. 400 μL 1×bindningsbuffert tillsattes, blandades och proverna detekterades med flödescytometri inom 1 timme.
[Anmärkningar]: För att undvika cellförlust under celltvätt kan en liten spets användas för att aspirera vätska.
1.2 Flödescytometrianalys
Alexa Fluor488 har en maximal excitationsvåglängd på 488 nm och en maximal emissionsvåglängd på 519 nm; Den maximala excitationsvåglängden för PI-DNA-komplex var 535 nm, och den maximala emissionsvåglängden var 615 nm. CellQuest och annan programvara användes för att analysera och rita en tvåfärgad punktplot med Alexa Fluor488 som abskissa och PI som ordinata. Samla in 10 000 händelser per prov.
1.3 Fluorescensmikroskopianalys
1) Släpp en droppe av cellsuspensionen dubbelfärgad med Annexin V-FITC/PI på objektglaset och täck cellerna med ett täckglas.
2) Det observerades under ett fluorescensmikroskop med ett tvåfärgsfilter. Annexin V-FITC-fluorescenssignalen var grön och PI-fluorescenssignalen var röd.