När celler genomgår apoptos aktiverar de endonukleasenzymer som skär genom DNA mellan nukleosomer. DNA-stege på 180-200 bp detekterades genom elektrofores efter DNA-extraktion under apoptos.
TUNEL (TdT-medierad dUTP Nick End Labeling) Apoptosdetektionskit (Alexa Fluor 488) kan användas för att detektera nukleär DNA-fragmentering i den sena apoptotiska processen av vävnadsceller. Principen är att under verkan av terminalt deoxinukleotidyltransferas (TdT), införlivas Alexa Fluor 488-12-DUTP i 3´-hydroxyl (3´-OH) terminalen som exponeras under genomiskt DNA-brott. Således kan det detekteras med fluorescensmikroskopi eller flödescytometri.
Alexa Fluor 488 färgämne är stabilare och har en starkare signal, vilket resulterar i ljusare markörer och större motståndskraft mot släckning.
Detta kit har ett brett utbud av applikationer och kan användas för att detektera apoptos i frysta eller paraffinsnitt, såväl som i odlade vidhäftande eller suspenderade celler.

Produktkomponenter

Frakt och förvaring

Komponenterna levereras med en ispåse och kan förvaras vid -20°C i 1 år.

Varningar

1. Det är nödvändigt att förbereda din egen PBS för att tvätta celler, en anti-fluorescenssläckande lösning för att försegla tabletter och 4% paraformaldehyd för fixering.

2. Endast för forskningsanvändning!

Instruktioner

1. Provberedningen
1.1 Paraffininbäddade vävnadssnitt
1.1.1. Paraffinvävnadssnitten nedsänktes i xylen i 5 minuter vid rumstemperatur och upprepades en gång för att avlägsna paraffin grundligt.
1.1.2. Blötlägg sektionerna i 100 % etanol i 5 minuter vid rumstemperatur och upprepa en gång.
1.1.3. Vid rumstemperatur blötlades proverna med gradientetanol (90, 80, 70%) under 3 minuter varje gång.
1.1.4. Skölj sektionerna försiktigt med PBS och torka försiktigt av överskottsvätskan runt provet på glasskivorna med filterpapper. I det här fallet kan paraffinpennan eller den hydrofoba pennan användas för att rita konturerna av provfördelningen runt provet, vilket är bekvämt för nedströms permeabilitetsbearbetning och balansmärkning. Låt inte provet torka under experimentet. Lägg det bearbetade provet i den våta lådan för att hålla provet vått.
1.1.5.2 mg/ml Proteinas K-lösning späddes med PBS i ett förhållande av 1:100 för att nå en slutkoncentration på 20 μg/ml.
1.1.6.100 μL Proteinas K-lösning i en koncentration av 20 μg/mL sattes till varje prov för att helt täcka det och inkuberades vid rumstemperatur i 20 minuter.
[Anmärkningar]: Proteinas K hjälper vävnader och celler att bli permeabla för färgningsreagensen i efterföljande steg. För lång inkubationstid ökar risken för att vävnadssektioner faller av bärarplattan i efterföljande tvättsteg, medan för kort inkubationstid kan orsaka otillräcklig permeabilitetsbehandling och påverka märkningseffektiviteten. För att få bättre resultat kan det vara nödvändigt att optimera inkubationstiden för Proteinase K.
1.1.7. Skölj provet 2-3 gånger med PBS-lösning, avlägsna försiktigt överflödig vätska och torka försiktigt vätskan runt provet på objektglaset med filterpapper. Det bearbetade provet placeras i en våt låda för att hålla provet fuktigt.
1.2 Fryst sektion av vävnad
1.2.1. Ta bort frysta sektioner och återgå till rumstemperatur. Objektglasen nedsänktes i 4% paraformaldehydlösning (upplöst i PBS) och fixerades och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur.
1.2.2. Ta försiktigt bort överflödig vätska och använd filterpapper för att försiktigt torka av överflödig vätska runt provet på objektglaset.
1.2.3. Objektglasen nedsänktes i PBS-lösning, inkuberades vid rumstemperatur under 15 minuter och tvättades med PBS igen 2 gånger totalt.
1.2.4. Ta försiktigt bort överflödig vätska och torka försiktigt av glasskivan med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska runt provet. I det här fallet kan paraffinpennan eller den hydrofoba pennan användas för att rita konturerna av provfördelningen runt provet, vilket är bekvämt för nedströms permeabilitetsbearbetning och balansmärkning. Under experimentet, låt inte provet torka och lägg det bearbetade provet i den våta lådan för att hålla provet vått.
1.2.5. 2 mg/ml Proteinas K-lösning späddes ut med PBS i förhållandet 1:100 för att nå en slutkoncentration på 20 μg/ml.
1.2.6. 100 μL Proteinas K-lösning i en koncentration av 20 μg/ml sattes till varje prov för att helt täcka det och inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter.
[Anmärkningar]: Proteinas K hjälper vävnader och celler att vara permeabla för färgningsreagenser i efterföljande steg. För lång inkubationstid ökar risken för att vävnadssektioner faller av bärarplattan i efterföljande tvättsteg, medan för kort inkubationstid kan orsaka otillräcklig permeabilitetsbehandling och påverka märkningseffektiviteten. Det kan vara nödvändigt att optimera inkubationstiden för Proteinas K om bättre resultat inte erhölls.
1.2.7. Skölj provet 2-3 gånger i en öppen bägare innehållande PBS-lösning.
[Anmärkningar]: För att undvika förlust av provavskalning i rengöringssteget rekommenderas det att inte tvätta flaskan, utan att blötlägga objektglasen i PBS-lösning 2-3 gånger för rengöring.
1.2.8. Ta försiktigt bort överflödig vätska och använd filterpapper för att försiktigt torka vätskan runt provet på objektglaset.Det bearbetade provet placeras i en våtlåda för att bevara provets fuktighet.
1.3 Förberedelse av cellcrawl-ark
Vidhäftande celler odlades på Lab-Tek of Chamber Slides. Efter apoptosinduktionsbehandling tvättades objektglasen två gånger med PBS.
1.4 Förberedelse av cellutstryk (med polylysinbelagda objektglas som exempel)
1.4.1. Cellerna återsuspenderades i PBS i en koncentration av cirka 2 × 107 celler/ml, 50-100 μL av cellsuspensionen aspirerades på polylysinbelagda objektglas och cellsuspensionen spreds försiktigt ut med ett rent objektglas.
1.4.2. Cellerna fixerades och objektglasen nedsänktes i en färgningstank innehållande 4% nyberedd paraformaldehyd i PBS och placerades vid 4°C under 25 minuter.
1.4.3. Objektglasen tvättades, nedsänktes i PBS och lämnades vid rumstemperatur i 5 minuter. Tvätta igen med PBS.
1.4.4. Ta försiktigt bort överflödig vätska och torka försiktigt av glasskivan med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska runt provet. I det här fallet kan en paraffinpenna eller hydrofob penna användas för att beskriva fördelningen av provet runt provet för att underlätta nedströms permeabilitetsbearbetning och balansering av märkningsoperationer. Under experimentet, låt inte provet torka och lägg det bearbetade provet i den våta lådan för att hålla provet vått.
1.4.5. 2 mg/ml Proteinas K-lösning späddes ut med PBS i förhållandet 1:100 för att nå en slutkoncentration på 20 μg/ml.
1.4.6. 100 μL Proteinas K-lösning i en koncentration av 20 μg/ml sattes till varje prov för att göra det helt täckt och inkuberat i rumstemperatur i 5 minuter (det kan också nedsänkas i 0,2 % Triton X-100-lösning framställd i PBS och inkuberas vid rumstemperatur i 5 minuter för permeabilitetsbehandling).
[Anmärkningar]: Proteinas K hjälper vävnader och celler att vara permeabla för färgningsreagenser i efterföljande steg. För lång inkubationstid ökar risken för att vävnadssektioner faller av bärarplattan i efterföljande tvättsteg, medan för kort inkubationstid kan orsaka otillräcklig permeabilitetsbehandling och påverka märkningseffektiviteten. Det kan vara nödvändigt att optimera inkubationstiden för Proteinas K om bättre resultat inte erhölls.
1.4.7. Skölj provet 2-3 gånger med PBS, ta försiktigt bort överflödig vätska och torka försiktigt vätskan runt provet på objektglaset med filterpapper. De behandlade proverna placerades i en våtlåda.
2. Steg för DNasbehandling av positiva kontroller
Efter provgenomträngning, celler behandlades med DNas I för att framställa positiva kontrollobjektglas. Denna process orsakar vanligtvis de flesta av cellerna behandlas för att visa grön fluorescens.
[Anmärkningar]: Dnas I-behandling av immobiliserade celler orsakar brott av kromosomalt DNA, vilket producerar många 3'-ändar av DNA som kan märkas.
2.1 Späd 10 × DNas I-buffert med avjoniserat vatten i förhållandet 1:10 (200 µL 1 × DNas I-buffert krävs för varje prov, det vill säga 20 µL 10 × DNas I-buffert och 180 µL avjoniserat vatten krävs för utspädning). En droppe på 100 ul sattes till det permeabla provet och inkuberades i 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 1 μL DNase I (1U/μL) till de återstående 100 μL av 1 × DNase I-buffert för att uppnå en slutkoncentration på 10 U/ml.
2.2. Vätskan tappades försiktigt av, sedan tillsattes 100 μL buffert innehållande 10 U/mL DNas I och inkuberades i 10 minuter vid rumstemperatur.
2.3.Knacka på objektglaset för att avlägsna överflödig vätska och tvätta objektglaset noggrant 3-4 gånger i en färgtank med avjoniserat vatten.
[Anmärkningar]: En separat färgningstank måste användas för de positiva kontrollobjektglasen, annars kan kvarvarande DNas I på de positiva kontrollglasen introducera en hög bakgrund på de experimentella objektglasen.
3. Märkning och detektion
3.1.Jämviktsbuffert (5 × jämviktsbuffert) späds ut med avjoniserat vatten i förhållandet 1:5 (100 μL 1 × jämviktsbuffert krävs för varje prov).
3.2. Jämviktsbuffert (100 μL 1 x Jämviktsbuffert) tillsattes till varje prov för att fullständigt jämvikta området och inkuberades i 10-30 minuter vid RT. Alternativt kan du skjuta in i en moms med 1 x ekvilibreringsbuffert för att säkerställa att objektglasen är i jämvikt. Tina Alexa Fluor 488-12-DUTP-märkning Blanda på is medan cellerna balanseras och förbered tillräckligt med TdT-inkubationsbuffert för alla experiment och valfria positiva kontrollreaktioner enligt tabell 1. För en standardreaktion med en yta på mindre än 5 cm2 är volymen 50 μl, och 50 μl multipliceras med T-positiva reaktionsvolymen för att bestämma den totala T-reaktionsvolymen av experiment inkubationsbuffert krävs. För prover med större ytareor kan reagensvolymen ökas proportionellt.

Tabell 1 TdT-inkubationsbuffertar förberedda för experiment och eventuella positiva kontrollreaktioner

[Negativt kontrollsystem]: En kontrollinkubationsbuffert utan TdT-enzym bereddes och TdT-enzymet ersattes med ddH2O.
3.3. Det mesta av 100 µl 1× ekvilibreringsbufferten tvättades av med absorberande papper runt det ekvilibrerade området och sedan sattes 50 µl TdT-inkubationsbuffert till en 5 cm2 yta av celler. Låt inte cellerna torka ut. Efter detta ska rutschbanan skärmas från ljus.
3.4. Placera ett täckglas av plast över cellerna för att säkerställa en jämn fördelning av reagenserna, och placera en pappershandduk fuktad med vatten i botten av den våta lådan. Objektglasen placerades i en våt låda och inkuberades vid 37 ℃ under 60 min. Slå in den våta lådan i aluminiumfolie för att skydda den från ljus.
[Anmärkningar]: Plastskyddsglaset kan skäras på mitten före användning. Vik kanten på täckglaset för enkel borttagning och hantering.
3.5. Plasttäckglasen avlägsnades och sektionerna inkuberades i PBS-lösning vid rumstemperatur under 5 minuter. Därefter tvättades sektionerna två gånger med färsk PBS.
3.6. Torka försiktigt av PBS-lösningen runt och på baksidan av provet med filterpapper.
[Anmärkningar]: För att minska bakgrunden, efter att ha tvättat objektglasen med PBS en gång, kan de tvättas med PBS innehållande 0,1 % Triton X-100 och 5 mg/mL BSA 3 gånger, 5 minuter varje gång, så att de fria oreagerade markörerna kan vara klara och rena.
3.7. Prover färgades i en färgningstank och objektglasen nedsänktes i en färgningstank innehållande PI-lösning (1 μg/ml, nyberedd och utspädd med PBS) i mörker och lämnades i rumstemperatur i 5 minuter. (Valfritt): Prover färgades i en färgningstank och objektglasen nedsänktes i en färgningstank innehållande DAPI-lösning (2 μg/ml, nyberedd och utspädd med PBS) i mörker och lämnades i rumstemperatur i 5 minuter.
3.8.Tvätta provet, doppa objektglaset i avjoniserat vatten och låt det stå i rumstemperatur i 5 minuter. Upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
3.9. Överskottsvattnet på objektglaset slogs torrt och 100 μl PBS sattes till provområdet för att hålla provet fuktigt.
3.10. Proverna analyserades omedelbart under ett fluorescensmikroskop och den gröna fluorescensen observerades vid 520±20 nm med en standard fluorescensfilteranordning. Den röda fluorescensen av PI observerades vid > 620 nm, eller den blå DAPI observerades vid 460 nm. Vid behov kan objektglasen förvaras över natten vid 4 ° C i mörker.
[Anmärkningar]: PI/DAPI kunde färga både apoptotiska och icke-apoptotiska celler röd/blå, och endast i apoptotiska kärnor var Alexa Fluor 488-12-DUTP inkorporerad och lokaliserad grön fluorescens.
4. Suspensionscellerna detekterades med flödescytometri
4.1. 3~5 × 106 celler tvättades två gånger med PBS genom centrifugering (300 × g) vid 4°C, centrifugerades vid 300 g vid 4°C under 10 minuter och återsuspenderades sedan i 0,5 ml PBS.
4.2. Cellerna fixerades och 5 ml 1% paraformaldehydlösning framställd i PBS tillsattes och placerades på is under 20 minuter.
4.3. Celler centrifugerades vid 300 x g vid 4°C under 10 minuter, och supernatanten avlägsnades och återsuspenderades i 5 ml PBS. Tvättningen upprepades en gång och cellerna återsuspenderades med 0,5 ml PBS.
4.4. Cellerna genomträngdes och 5 ml is-förkyld 70% etanol tillsattes och inkuberades vid -20°C under 4 timmar. Cellerna kan förvaras i 70 % etanol vid -20 ℃ under en vecka, eller så kan cellerna vara permeabla med 0,2 % Triton X-100-lösning framställd i PBS och förvaras vid rumstemperatur i 5 minuter.
4.5. Celler centrifugerades vid 300 x g under 10 minuter och återsuspenderades i 5 ml PBS. Centrifugeringen upprepades och återsuspenderades i 1 ml PBS.
4.6. Överför 2x106 celler till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
4.7. Jämvikt centrifugerades vid 300 × g i 10 minuter och supernatanten avlägsnades och återsuspenderades med 80 μL 1 × jämviktsbuffert. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
4.8. Medan cellerna balanserades smältes Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix på is och tillräckligt med TdT-inkubationsbuffert för alla reaktioner bereddes enligt Tabell 1. För en standardreaktion på 2×106 celler är volymen 50 μL och 50 μL gånger antalet reaktioner som krävs är den totala volymen av Td Td inkubationsbuffert.
4.9. Cellerna centrifugerades vid 300 × g i 10 minuter, supernatanten avlägsnades och fällningen återsuspenderades i 50 μL TdT-inkubationsbuffert och inkuberades vid 37 ℃ i 60 minuter, avskärmad från ljus. Celler återsuspenderades försiktigt var 15:e minut med en mikropipett.
4.10. Reaktionen avslutades genom tillsats av 1 ml 20 mM EDTA och försiktig blandning med en mikropipett.
4.11. Efter centrifugering vid 300 g under 10 minuter kastades supernatanten och fällningen återsuspenderades i 1 ml 0,1 % Triton X-100-lösning framställd i PBS, innehållande 5 mg/ml BSA. Lösningen upprepades en gång och tvättades två gånger totalt.
4.12. Supernatanten kasserades genom centrifugering vid 300 g i 10 minuter, och cellerna återsuspenderades i 0,5 ml 5 μg/mLPI-lösning som nyligen framställts med PBS, som innehöll 250 μg DNas-fritt RNase A.
4.13. Celler inkuberades i mörker under 30 minuter vid rumstemperatur.
4.14. Cellerna analyserades med flödescytometri och den gröna fluorescensen observerades vid 520±20 nm. Den röda fluorescensen av PI observerades vid > 620 nm. PI kunde färga både apoptotiska och icke-apoptotiska celler röda, och endast i apoptotiska kärnor var Alexa Fluor 488-12-DUTP inkorporerad och lokaliserad grön fluorescens.