Beskrivning
MycAway™ Mycoplasma qPCR Detection Kit är en produkt utformad för kvalitativ detektering av mykoplasmakontamination i olika källor, inklusive råmaterial, cellbanker, virusfrön, virus- eller cellskördande lösningar och celler som används i bland annat kliniska behandlingar. Detta kit använder Taqman fluorescerande prober (FAM och VIC) och använder tekniker för multipel polymeraskedjereaktion (PCR) för att separat detektera målet och intern kontroll. Den har validerats för specificitet, detektionsgräns och robusthet enligt EP <2.6.7>-standarder, vilket visar hög känslighet, specificitet, effektivitet och säkerhet. Detektionsgränsen är lika med eller under 10 CFU/mL.
För nukleinsyraextraktion kan denna produkt användas tillsammans med MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat#18461), som använder manuella extraktionsmetoder. Alternativt kan nukleinsyror i prover extraheras automatiskt med den automatiska nukleinsyraextraktorn AutoPure 32A (Cat#80501) och MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA (Cat#18462). Det är viktigt att notera att kit som innehåller Cat#18461 och Cat#40619 har genomgått en omfattande validering; för detaljerad valideringsinformation, kontakta vår tekniska support. Efter att proverna förbehandlats för att ta bort störande föroreningar och erhålla renade nukleinsyror, utförs en qPCR-reaktion med en realtids-PCR-förstärkare, och fluorescenssignalen från sonden samlas in och analyseras.
| Kat.nr. | 40619ES25 / 40619ES60 |
| Storlek | 25 T / 100 T |
| Upptäckt Begränsa | 10 CFU/ml |
| Upptäcka metod | qPCR metod (Taqman fluorescerande) |
| Varaktighet | 4 timmar |
| Fluorescerande sond | FAM (Mål kanal)；VIC (Inre kanal) |
| Täckt mykoplasma | ≥ 100 |
| Godkännande | Validerad enligt till EP <2.6.7> |
Komponenter
| Komponentnr. | Namn | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | 4×MyqPCR-reaktionsbuffert | 250 μL | 1 ml |
| 40619-B | MyPrimer & Probe BLANDA | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | Intern kontroll (IC) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | Positiv kontroll (PC) | 500 μL | 2 ml |
| 40619-E*** | DNA-spädning buffert | 1 ml | 4×1 ml |
| 40619-F**** | Ultrarent vatten | 500 μL | 2×1 ml |
*IC: Internt kontrollera;
**PCS: Positivt kontrollera lösning ,de koncentration är 1 000 kopior/µL.
***DNA Utspädning buffert: används för IC utspädning och de mall av NTC och NCS.
****Ultrapure vatten: används för de förberedelse av qPCR Blanda.
Lagring
Denna produkt bör förvaras vid -25~-15 ℃ i 2 år.
*Vid mottagandet av satsen, kontrollera om alla komponenter är kompletta och förvara dem omedelbart i -25~-15℃ tillstånd om inte utför analysen omedelbart. Observera att 40619-B bör förvaras borta från ljus.
Instruktioner
- Förberedelser före experiment
1） Förbered de nödvändiga reagenserna och materialen som kommer att användas i experimentet.
2）Bekräfta lämpligheten av qPCR-instrumentet
Detta kit kan användas på typerna av qPCR-instrument enligt nedan:
- Bio-Rad: CFX96
- Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System；QuantStudio™5；
- Experimentmetod
1） DNA-extraktion
Vi rekommenderar att använda ' Förberedelsesats för magnetisk rest av DNA-prov' (Katt#18461ES för manuell extraktion och Katt#18462ES för automatisk extraktion) för DNA-extraktion, du burk besök ' http:/www.yeasenbiotech.com ' för de
detaljerad information och inköp.
Satsen (Cat#40619ES) innehåller en intern kontroll (IC). Om du lägger till IC till proverna före DNA-extraktion kan den verifiera hela processen (inklusive DNA-extraktion och qPCR-reaktion). Om tillsätt IC till qPCR-mastermixen
direkt, IC kommer endast att fungera som en qPCR-kontroll.
2）qPCR-blandningsberedning
- Enligt provmängden som inkluderade positiv kontroll (PCS), ingen mallkontroll (NTC), negativ kontrolllösning (NCS) och testprov (TS) för att beräkna antalet reaktioner. Förbered 2 reaktioner parallellt för
varje prov i allmänhet.
* PCS: Positivt kontrollera lösning；NTC: Nej mall kontroll；NCS: Negativ kontrollera lösning；TS: Testa prov. Det är inga behov till utföra
de prov extraktion för PCS och NTC, men NCS och TS är behövs.
Reaktionsbrunnar（M1）=（1×NCS + N×TS） ×2
Reaktionsbrunnar（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2
Reaktionsbrunnar（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2
- Förtina den erforderliga mängden reagens på is enligt experimentdesignen och tabellerna nedan.
- Beräkna mängden qPCR Mix enligt antalet reaktioner. Observera att om kitet kommer att användas för GMP-aktiviteter såsom produktsläpp, rekommenderade vi att använda Tabell 1 och 2 för beredningen; Om satsen kommer precis används för forskning och det finns inget behov av att lägga till IC före extraktionen efter utvärderingen, följ sedan tabell 3 för
förberedelsen. Observera att inte alla M1, M2 och M3 är behövde vara förbereda.
| Komponent | Volym（1×40μL reaktioner） | Volym（M1×40μL） |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffert | 10 μL | (M1+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDA | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M1+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Renat vatten | Fram till 20 μL | Upp till (M1+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M1+2) ×20 μL |
Tabell 1 qPCR Mix-system för M1
*De konfiguration system i Tabell 1 är baserad på de premiss att IC är lagt till före extraktion för både NCS och TS, alltså det är inte nödvändig
till tillägga IC när qPCR Blanda förberedelse. IC lägga till metod före extraktion: Späd först ut IC av 20 gånger med DNA spädningsmedel och tillägga 1 μL
utspädd IC till varje 100 μL testa prov för de ytterligare extraktion.
**Detta utrustning gör inte innehålla ROX Hänvisning Färga. Om ROX hänvisning färga är behövs för de Verklig Tid PCR förstärkare att du är för närvarande använder, 50×ROX Hänvisning Färga (Katt#10200ES) är rekommenderad för använda. I detta fall, den lagt till volym är 0,8 μL, som visas i Tabell 1. Om använder andra
varumärken av ROX produkter, tack hänvisa till deras instruktioner för ROX tillägg.Om inga ROX hänvisning färga är krävs, den lagt till volym är 0 μL.
| Komponent | Volym（1×40μL reaktioner） | Volym（M2×40μL） |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffert | 10 μL | (M2+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDA | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| Intern kontroll（IC） | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M2+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Renad vatten | Upp till 20 μL | Upp till (M2+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M2+2) ×20 μL |
Tabell 2 qPCR Mix-system för M2
*De konfiguration system i Tabell 2 är baserad på de premiss att IC är inte lagt till i PCS och NTC före extraktion, så IC behov till vara lagt till under qPCR Blanda förberedelse. IC lägga till metod efter extraktion: Utspädd IC av 100 gånger med DNA utspädningsmedel och tillägga 1 μL utspädd IC till
varje qPCR Blanda system.
**Detta utrustning gör inte innehålla ROX Hänvisning Färga. Om ROX hänvisning färga är behövs för de Verklig Tid PCR förstärkare att du är för närvarande använder, 50×ROX Hänvisning Färga (Katt#10200ES) är rekommenderad för använda. I detta fall, den lagt till volym är 0,8 μL, som visas i Tabell 1. Om använder andra
varumärken av ROX produkter, tack hänvisa till deras instruktioner för ROX tillägg. Om inga ROX hänvisning färga är krävs, den lagt till volym är 0 μL.
| Komponent | Volym（1×40μL reaktioner） | Volym（M3×40μL） |
| 4× MyqPCR-reaktionsbuffert | 10 μL | (M3+2) ×10 μL |
| MyPrimer & Probe BLANDA | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| Intern kontroll（IC） | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M3+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Renad vatten | Upp till 20 μL | Upp till (M3+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M3+2) ×20 μL |
Tabell 3 qPCR Mix-system för M3
*De konfiguration system i Tabell 3 är baserad på de premiss att IC är inte lagt till till prover före utvinning, alltså IC behov till vara lagt till under qPCR Blanda förberedelse. IC lägga till metod efter extraktion: Utspädd IC av 100 gånger med DNA utspädningsmedel och tillägga 1 μL till varje qPCR Blanda
system.
**Detta utrustning gör inte innehålla ROX Hänvisning Färga. Om ROX hänvisning färga är behövs för de Verklig Tid PCR förstärkare att du är för närvarande använder, 50×ROX Hänvisning Färga (Katt#10200ES) är rekommenderad för använda. I detta fall, den lagt till volym är 0,8 μL, som visas i Tabell 1. Om använder andra
varumärken av ROX produkter, tack hänvisa till deras instruktioner för ROX tillägg. Om inga ROX hänvisning färga är krävs, den lagt till volym är 0 μL.
3）Lägg till mallar
- Blanda qPCR Mix med tillräcklig skakning, centrifugera vid låg hastighet och samla upp restvätskan från locket
till botten av röret.
- Lägg till 20 μL qPCR Blanda till varje reaktionsrör/brunn. Observera att du lägger till motsvarande qPCR-blandning i varje
provrör och undvik att lägga till fel.
- Lägg till mallar till röret/brunnarna som innehöll qPCR-blandningen. Se tabell 4 för att lägga till mallar.
| Testa prover | I varje rör eller väl … |
| TS | 20 μL qPCR Mix+20 μL Prover efter extraktion |
| NTC | 20 μL qPCR Mix+20 μL DNA Utspädning buffert |
| NCS* | 20 μL qPCR Mix+20 μL Negativt prov efter extraktion* |
| PCS | 20 μL qPCR Mix +20 μL positiv kontrollera |
Tabell 4 mallar lägga till
*Vi rekommenderar att använda DNA-spädningsbuffert (40619-E) som mall för NCS för DNA-extraktionen.
**De total reaktion volym i varje rör/brunn är 40 μL.
***Täcka de rör lock eller de tallrik filma. Till undvika påverkar de fluorescens signal läs, snälla ta vård inte till märke de rör lock eller filma
eller även gnugga de filma upprepat med a skrapa.
****Centrifug de reaktion rör eller tallrik kort på låg hastighet efter mallar lägga till. Efter tillräcklig skakning och blanda, upprepa centrifug
på låg hastighet till samla de flytande från de lock eller vägg till de botten. Undvika bubblor när drift. De baslinje vilja vara påverkas om de blanda
är inte blandad tja, alltså detta steg är mycket viktig till a bra experimentera resultat.
4）qPCR-programinställning
- Programfilinställningar
Exempel (7500 Real-Time PCR System-instrument och Real-Time PCR Software v2.4):
Instrumenttyp: 7500 (96 brunnar)
Experimenttyp: Kvantifiering-standardkurva;
Kemi: Taqman®-reagenser
Ramphastighet: Standard (~2 timmar för att slutföra en löprunda)
- Inställningar för målkanal
I "Definiera Mål och Prover" av "Tallrik Setup", skapa a Mål 1 kanal (FAM), välja FAM som de rapportering fluorescensgrupp och MGB eller ingen som släckningen fluorescens grupp. Skapa a Mål 2 kanal (VIC), välja de rapportering fluorescens grupp som VIC och de släckning fluorescens grupp som ingen. I "Tilldela Mål och Prover" av "Tallrik Setup", om inga ytterligare ROX färga är lagt till, välj "ingen"; Om en ytterligare ROX är lagt till, välj
ROX.
- Standard förstärkningsprogram Inställningar
| S/N | Reaktionsstadiet | Temperatur | Tid | Cykel(er) |
| 1 | Initial denaturering | 95 ℃ | 5 min | 1 |
| 2 | Denaturering | 95 ℃ | 15 sek |
45 |
| 3 | Glödgning/förlängning (fluorescenssignalinsamling) |
62℃ |
30 sek |
Tabell 5 Inställningar för standardförstärkningsprogram
- Baslinje och tröskelinställning:
Princip av baslinje justering: använda de automatisk baslinje i allmänhet. Om behov till justera i manuell, välja de cykel före den exponentiella tillväxten period som startcykeln, och undvik fluktuationszonen för första fluorescens samling. Välj cykeln som är 1-2 cykler före Ct för det tidigaste exponentiella amplifieringsprovet som
slutpunkt.
Princip av tröskel justering: använd den automatiska tröskeln i allmänhet. Om behovet av att justera i manuellt, tröskeln skall vara uppsättning högre än de Negativ prov eller de baslinje buller, dess i allmänhet uppsättning tröskeln i de sent
skede av den exponentiella förstärkningen, relativt oberoende och lämplig tröskel behövs för varje tunnel.
5） Resultat Analys
- Resultatbedömning för PCS, NTC och NCS:
Om IC läggs till: specifikationen för varje kontrollprov bör vara uppfyllda i tabell 6:
| Kontrollprov | FAM Signal | VIC-signal |
| PCS | Ct < 40, och har en tydlig förstärkningskurva | Ct < 40 och har tydlig amplifieringskurva |
| NTC | Ct ≥ 40 eller ingen uppenbar amplifieringskurva | Ct < 40 och har tydlig amplifieringskurva |
| NCS | Ct ≥ 40 eller ingen uppenbar amplifieringskurva | Ct < 40 och har tydlig amplifieringskurva |
Tabell 6 Resultat dom av PCS, NTC och NCS
Om IC inte läggs till: varje kvalitetskontrollprov ska uppfylla specifikationen för FAM-signalkolumnen i Tabell 6, och ingen
behöver analysera VIC-kanal.
- Resultatbedömning för TS
Nödvändig förutsättning: Det är nödvändigt för att avgöra om PCS, NTC och NCS klarade specifikationen i tabell 6 före TS resultatanalys. Om godkänd, då kan fortsätt till nästa steg. Om inte gått, de TS resultat maj inte vara pålitlig, och
orsaken måste utredas.
Om IC har lagts till: hitta motsvarande resultat bedömning enligt resultatinformationen från FAM och VIC i tabell 7:
| FAM Signal | VIC-signal | Resultat dom |
| Ct<40 och har uppenbar förstärkningskurva | Ct<40 och har tydlig amplifieringskurva | Positiv |
| Ct≥40 eller ingen uppenbar amplifieringskurva | En hämning finns, den experimentet måste upprepas | |
| Ct≥40 eller ingen uppenbar förstärkningskurva | Ct<40 och har tydlig amplifieringskurva | Negativ |
| Ct≥40 eller ingen uppenbar amplifieringskurva | En hämning finns, den experimentet måste upprepas |
Tabell 7: Resultat dom av TS (IC lagt till)
*Om det är hämning för VIC signal, behandling är behövs till eliminera de inhibitorer eller upprepa de testa.
Om IC inte har lagts till: hitta motsvarande resultat dom enl resultatinformationen för FAM i tabell 8 , och det är inte nödvändigt att analysera VIC-signal.
| FAM-signal | Resultat dom |
| Ct<40 och har tydlig amplifieringskurva | Positiv |
| Ct≥40 eller ingen uppenbar amplifieringskurva | Negativ |
Tabell 8: Resultat dom av TS (IC inte lagt till)
Anteckningar
- Läs denna bruksanvisning noggrant innan du använder detta kit. Experimentet bör utföras på ett standardiserat sätt, inklusive provhantering, beredning av reaktionssystem och provtillsättning.
- Fortsätt att tillsätta prover och förbereda reagens på is om möjligt.
- Vortexa och blanda väl för varje reagens före användning.
- Vänligen använd labbrockar och engångshandskar, för din säkerhet.
- Denna produkt är endast avsedd för forskning.
[1] Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C.Effekter av kosttillskott med Epigallocatechin Gallate på köttkvalitet och muskelantioxidantkapacitet hos slaktkycklingar som utsätts för akut värmestress. Djur (Basel). 2021;11(11):3296. Publicerad 2021 18 november. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752)
Betalning och säkerhet
Din betalningsinformation behandlas säkert. Vi lagrar inte kreditkortsuppgifter och har inte heller tillgång till din kreditkortsinformation.
Förfrågan
Du kanske också gillar
Vanliga frågor
Produkten är endast avsedd för forskningsändamål och är inte avsedd för terapeutisk eller diagnostisk användning hos människor eller djur. Produkter och innehåll skyddas av patent, varumärken och upphovsrätt som ägs av Yeasen Biotechnology. Varumärkessymboler anger ursprungsland, inte nödvändigtvis registrering i alla regioner.
Vissa applikationer kan kräva ytterligare immateriella rättigheter från tredje part.
Yeasen är dedikerad till etisk vetenskap, och anser att vår forskning bör behandla kritiska frågor samtidigt som den säkerställer säkerhet och etiska standarder.