Polybrene (hexadimetrinebromid), även känd som Polybrene, är en katjonisk polymer som vanligtvis används i DNA-transfektionsexperiment med däggdjursceller för att förbättra transfektionseffektiviteten hos liposomer. Det används i stor utsträckning vid retrovirusmedierad gentransfektion och lentivirusmedierad gentransfektion. Verkningsmekanismen kan involvera neutralisering av sialinsyran på cellytan, vilket underlättar adsorption genom att övervinna elektrostatisk repulsion med viruspartiklar. Polybrene är också känt som ett antikoagulant (heparinantagonist) och används ofta vid produktion av icke-specifikt aggregerade röda blodkroppar. Dessutom, vid proteinsekvensering, har låga doser av Polybrene visat sig signifikant förbättra nedbrytningen av peptider i automatiserad sekvensanalys. Tillsatsen av polybren till PVDF-membran kan också förbättra membranaffiniteten.

Specifikation

Produkten tillhandahålls i lösningsform och pulvret rekonstitueras i 0,9 % NaCl för att göra en 10 mg/ml lösning, som sedan steriliseras med ett 0,22 μm filter. Det späds vanligtvis i ett förhållande av 1:1000-1:2000 för användning, med specifika utspädningsförhållanden beroende på celltyp, enligt beskrivning i relevant litteratur.

Frakt och förvaring

Transport och förvaring rekommenderas vid -20 ºC, med en hållbarhet på 2 år. Det rekommenderas att alikvotera och förvara för att undvika upprepade frys-upptiningscykler.

Försiktighetsåtgärder:

1. Bär laboratoriekläder och engångshandskar för säkerhet och hälsa.

2. Denna produkt är endast avsedd för forskningsändamål.

Operativa steg

(för referens, specifika koncentrationer kan variera, se relevant litteratur):

Obs: Polybrene kan uppvisa betydande toxicitet för vissa celler (såsom terminalt differentierade neuroner, DC-celler), och ett toxicitetstest rekommenderas för initial användning.

Experiment 1: Retroviral infektion

1. Beredning av rekombinant retrovirusstam: Odla celler innehållande ett monolager av transfektionsretrovirusförpackningsceller i en 100 mm skål med 5 ml tillväxtmedium (5 % serum). Efter 24 timmar, ta bort odlingsmediet och filtrera det genom ett 0,45 μm filter.

2. Odla celler för infektion: I en 100 mm skål, tillsätt 10 ml komplett tillväxtmedium med en celldensitet på 5×10⁵ per maträtt.

3. Virusinfektion: Efter 24 timmars cellodling, avlägsna hela odlingsmediet. Infektera celler med 2 mL virussupernatant innehållande Polybrene (slutkoncentration: 5-10 μg/mL) vid 37°C i 3-6 timmar.

4. Samla in viruspartiklar: Tillsätt 8 ml komplett tillväxtmedium. Efter 2-3 dagars odling, samla upp odlingsmediet för att erhålla viruspartiklar.

Experiment 2: Transfektion

1. Odla celler i komplett tillväxtmedium med en celltäthet på cirka 50 %.

2. Efter 18-24 timmars cellodling, förbered en DNA-tillväxtmedium-polybrenblandning. Tillsätt komplett odlingsmedium (2 mL för en 60 mm skål, 3 mL för en 100 mm skål) och förvärm till 37°C. Blanda försiktigt 10 ng~10 µg plasmid. Tillsätt Polybrene till en slutlig koncentration av 5-10 μg/mL. Blanda försiktigt. Varje komponent ska läggas till i angiven ordning.

3. Ta bort odlingsmediet och tillsätt DNA-tillväxtmedium-Polybrene-lösningen till cellerna vid 37°C i 6-20 timmar. Blanda försiktigt var 1,5 timme inom de första 6 timmarna av cellodlingen.

4. Ta bort DNA-tillväxtmedium-polybrenlösningen. Täck cellerna med DMSO-chocklösning (15 % DMSO i 1× HBSS).Skaka odlingsskålen försiktigt i 10 sekunder varje gång lösningen tillsätts för att säkerställa jämn fördelning. Inkubera cellerna vid 37°C i 4 minuter.

5. Ta omedelbart bort DMSO-chocklösningen och tvätta försiktigt cellerna två gånger med komplett tillväxtmedium. För en 60 mm skål, tvätta med 5 mL odlingsmedium varje gång, och för en 100 mm skål, tvätta med 10 mL odlingsmedium varje gång.

6. Lägg till komplett tillväxtmedium till cellerna.

7. Proteinuttryck: Efter 24-72 timmars odling, samla in celler för proteinuttrycksanalys vid behov.

Cellurval: Efter 24-72 timmars odling, baserat på cellstatus, byt till färskt selektionsmedium och fortsätt med cellurval.