Vero Värdcells-DNA Residue Detection Kit används för kvantitativ analys av Vero-värdcell-DNA-rester i mellanprover, halvfabrikat och färdiga produkter av olika biologiska produkter.

Detta kit använder Taqman fluorescerande sond och polymeraskedjereaktionsmetoden (PCR), som har en lägsta detektionsgräns på fg-nivå och kan specifikt och snabbt detektera kvarvarande Vero-cell-DNA. Satsen måste användas tillsammans med Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES).

Produkt Komponenter

^*IC: Intern kontroll

Frakt och förvaring

1. Skickas på torris och förvaras vid -20°C för 2 år

2. Efter att ha mottagit varorna, vänligen kontrollera och förvara dem i motsvarande lagringstemperatur omedelbart.

Varningar

1. Läs denna manual noggrant innan du använder detta reagens, och experimentet bör standardiseras, inklusive provhantering, förberedelse av reaktionssystem och provtillsats.

2. Att lägga till prover och förbereda lösningar görs bäst på is.

3. Se till att varje komponent är helt vortexad och centrifugerad vid låg hastighet före användning.

4. För din säkerhet och hälsa, vänligen bär laboratorierockar och engångshandskar vid användning.

5. Denna produkt är ENDAST för forskningsanvändning!

Tillämpliga instrumentmodeller

Inkludera men inte begränsat till:

Bio-Rad: CFX96 optisk modul.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus.

Använder Instruktion

1. Vero DNA-standardspädning och standardkurvberedning

Vero DNA-kontrollen späddes ut med en utspädningsbuffert med DNA-spädningsbufferten som medföljde i satsen, och spädningskoncentrationen är 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Se detaljerade instruktioner nedan:

1.1 Tina upp Vero DNA-kontroll och DNA-spädningsbuffert på is. Efter fullständigt upptining, vortexa försiktigt för att blanda och centrifugera vid låg hastighet i 10 sekunder.

1.2 Ta ut sex rena 1,5 ml rör, märkta med 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Tillsätt 90 μL DNA-spädningsbuffert och 10 μL Vero DNA-kontroll till 1:an.5 mL mikrofugrör märkt 3 ng/μL, och späd till 3 ng/μL. Blanda och centrifugera sedan i 10 sekunder. Underförpacka den utspädda DNA-standarden och den kan förvaras på kort sikt (högst 3 månader) vid -80°C. Undvik upprepad frys-upptining.

1.4 Tillsätt 90 μL DNA-spädningsbuffert till annan rör, följ sedan proceduren nedan för serieutspädningarna.

[Anteckningar]:

1. Tre replikatbrunnar krävs för varje koncentration. Detekteringsintervallet är 3 fg/μL-300pg/μL och detta sortiment kan utökas vid behov.

2. För att minska antalet upprepade frys-upptining och undvika kontaminering, rekommenderas att lagra DNA-kontrollen i alikvoter vid -80°C för första gången.

3. När den väl tinats kunde DNA-spädningsbuffert förvaras vid 2-8°C i 7 dagar, om den inte används under en längre tid, förvara vid -20°C.

4. Se till att mallen är helt blandad, skaka blandningen försiktigt i 15 sekunder till 1 min för varje gradientutspädning.

2. Extraction Recovery Control (ERC) förberedelse

Ställ in koncentrationen av Vero DNA i ERC efter behov (ERC-provet bereddes med 3 pg/μL DNA som ett exempel), enligt följande:

2.1 Tillsätt 100 μL testprov i ett rent 1,5 mL rör, tillsätt sedan 10 μL 3pg/μL Vero DNA-standard (③) och blanda väl, märkt som ERC.

2.2 Utför DNA-extraktionen av ERC-provet tillsammans med testproverna för att förbereda den renade ERC prov.

3. Positiv kontrollprov (PCS) beredning (valfritt)

Ställ in koncentrationen av Vero DNA i PCS efter behov (PCS bereddes med 3 pg/μL DNA som ett exempel), enligt följande:

3.1 Tillsätt 100 μL 3 pg/μL Vero DNA-standard (③) i ett rent 1,5 ml rör, märkt sedan som PCS.

3.2 Utför DNA-extraktionen av PCS tillsammans med testproverna för att förbereda den renade PCS.

4. Negativ Beredning av kontrolllösning (NCS).

Ställ in den negativa kontrollen i experimentet, de specifika operationsstegen är som följer:

4.1 Tillsätt 100 μL provmatris (eller DNA-spädningsbuffert) i ett rent 1,5 ml rör, märkt sedan som NCS.

4.2 Utför DNA-extraktionen av NCS-provet tillsammans med testproverna för att förbereda det renade NCS-provet.

5. Ingen mallkontroll (NTC) förberedelse

Ställ in mallen nej kontroll i experimentet, de specifika operationsstegen är som följer:

5.1 NTC kräver ingen provförbehandling och kan konfigureras vid qPCR-detektion av kvarvarande DNA-innehåll.

5.2 NTC-provet i varje rör eller brunn är 20 μL Blanda (dvs 16 μL Vero qPCR mix + 4 μL Vero Primer&probe mix) + 20 μL DNA-spädningsbuffert. Det rekommenderas att konfigurera tre replikatbrunnar.

6. PCR-reaktionssystem

[Anteckningar]:

1. Beräkna den totala PCR-reaktionsvolymen efter antalet reaktioner: qPCR Mix =(antalet reaktioner+2) × (16+4) μL (inklusive förlusterna av två reaktionsbrunnar). Mer än tre replikat för varje prov rekommenderas i experimentet.

2. Efter att ha täckt röret eller förseglat plattan, centrifugera reaktionsröret eller plattan vid låg hastighet i 10 sekunder. Efter tillräcklig skakning och blandning i 5 sekunder, upprepa centrifugeringen för att samla upp vätskan från locket eller väggen till botten. Undvik bubblor under drift.

Se nedanstående tabell för den rekommenderade plattinställningen:

Plattlayouten inkluderar: 1 NTC (nr mall kontroll), 1 NCS (negativ kontroll lösning), 6 STD (standardkurvan på 6 standardkoncentrationer), 3 TS (testprover), 3 ERC (extraction recovery control), 1 PCS (positivt kontrollprov).Tre replikatbrunnar för varje prov.

7. Inställningsriktlinjer för ett PCR-instrument (2-stegs metod)

Följande instruktioner gäller endast för Thermo ABI 7500 qPCR-instrument (Programversion 2.0). Om du använder ett annat instrument, se tillämplig instrumentguide för installationsriktlinjer.

7.1 Skapa ett nytt experiment, välj mallen för absolut kvantifiering eller användardefinierad.

7.2 I 'Definiera'-gränssnittet och 'Targets'-rutan, lägg till ett mål och namnges som FAM, välj reportern som 'FAM' och quenchern som 'ingen'.

7.3 I rutan 'Sampler' lägger du till all information om exempel i tur och ordning. Välj sedan brunnarna, välj målet och proverna på motsvarande sätt. Ställ in uppgiften för Vero DNA-standard som standard och tilldela värdena 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (enheten för DNA-koncentration i varje brunn är fg/μL) i kolumnen Kvantitet och namnge brunnarna STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, på motsvarande sätt. Ställ in uppgiften för NTC som NTC. Ställ in NCS, TS, ERC och PCS som Okänd, och namngav dem enligt ovanstående plattlayout på motsvarande sätt. Klicka sedan på nästa.

7.4 Ställ in amplifieringsprogrammet: ställ in reaktionsvolymen på 40 μL.

8. Analys av qPCR-resultat

8.1 Systemet ger automatiskt tröskelvärdet i Amplification Plot-panelen Analys. Tröskeln som ges av systemet är ibland för nära baslinjen, vilket resulterar i en stor skillnad i Ct mellan replikatbrunnar. Du kan manuellt justera tröskeln till en lämplig position och klicka på Analysera. Sedan kan du först kontrollera om amplifieringskurvan är normal i Multicomponent Plot.

8.2 På fliken Resultatanalys granskar du standardkurvans plot. Verifiera värdena för Slope, Y-intercept, R2 och effektivitet. För en normal standardkurva, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 I "Se brunnsbord" rutan i Analys, koncentrationerna av varje prov visas i Kvantitet, enheten är fg/μL, enheterna kan konverteras till pg/μL eller pg/ml i analysrapporten.

Manualer