E.coli Host Cell DNA Residue Detection Kit används för den kvantitativa analysen av E.coli värdcells-DNA-rester i mellanprover, halvfabrikat och färdiga produkter av olika biologiska produkter.

Detta kit använder Taqman fluorescerande sond och polymeraskedjereaktionsmetoden (PCR), som har en lägsta detektionsgräns för fg-nivå och kan specifikt och snabbt detektera kvarvarande E. coli cell-DNA. Satsen måste användas tillsammans med Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat# 18461ES).

Valideringsrapport

Specifikationer

Komponenter

Lagring

Denna produkt bör förvaras vid -25~-15 ℃ i 2 år.

Både 41308-A och 41308-B bör förvaras skyddade från ljus.

Tillämpliga instrumentmodeller

Inkludera men inte begränsat till:

Bio-Rad: CFX96 optisk modul.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Instruktioner

1. E.coli. DNA-standardspädning och standardkurvberedning

E.coli DNA-kontrollen gradientspäddes med hjälp av DNA-spädningsbufferten som medföljde i satsen^*och spädningen

koncentrationen är 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL.

Se detaljerade instruktioner nedan:

• Tina coliDNA-kontrollen och DNA-spädningsbufferten på is. Efter fullständigt upptining, vortexa försiktigt för att blanda och centrifugera vid låg hastighet i 10 sekunder.
• Ta ut sex rena 1,5 ml rör, märkta med Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5.
• Tillsätt 90 μL DNA-spädningsbuffert och 10 μL coliDNA Control till 1,5 mL mikrofugröret märkt Std0, nämligen späd till 3 ng/μL. Blanda och centrifugera sedan i 10 sekunder. Förpacka den utspädda DNA-standarden och den kan lagras på kort sikt (högst 3 månader) vid -25~-15 ℃^**. Undvik upprepad frys-upptining.
• Tillsätt 90 μL DNA-spädningsbuffert i andra rör^***, följ sedan proceduren nedan för serieutspädningarna^****.

Tabell 1 Standardgradientspädning

^*Tre replikatbrunnar krävs för varje koncentration. Detektionsintervallet är 30 fg/μL~300pg/μL och detta intervall kan utökas.

^**För att minska antalet upprepade frys-upptining och undvika kontaminering, rekommenderas att förvara DNA-kontrollen i alikvoter vid -25~-15 ℃ för första gången.

^***Efter upptining kan DNA-spädningsbuffert förvaras vid 2-8°C i 7 dagar, om den inte används under en längre tid, vänligen förvara vid -25~-15℃.

^****Se till att mallen är helt blandad, skaka försiktigt blandningen i 15 sekunder till 1 min för varje gradientspädning.

2. Extraction Recovery Control (ERC) förberedelse

Ställ in koncentrationen av E.coli DNA i ERC efter behov (ERC-provet preparerades med 30 pg E.coli DNA som ett exempel), enligt följande:

• Tillsätt 100 μL testprov i ett rent 1,5 mL rör, tillsätt sedan 10 μL 3pg/μL E.coli DNA Standard (Std3) och blanda väl, märkt som ERC.
• Utför DNA-extraktionen av ERC-provet tillsammans med testproverna för att förbereda det renade ERC-provet.

3. Beredning av negativ kontrolllösning (NCS).

Ställ in den negativa kontrollen i experimentet, de specifika operationsstegen är som följer:

1) Tillsätt 100 μL provmatris (eller DNA-spädningsbuffert) i ett rent 1,5 ml rör, märkt sedan som NCS.

2) Utför DNA-extraktionen av NCS-provet tillsammans med testproverna för att förbereda det renade NCS-provet.

4. Ingen mallkontroll (NTC) förberedelse

Ställ in ingen mallkontroll i experimentet, de specifika operationsstegen är som följer:

1) NTC kräver ingen provförbehandling och kan konfigureras vid qPCR-detektion av kvarvarande DNA.

2) NTC-provet i varje rör eller brunn är 20 μL Mix (dvs. 15 μL E.coli qPCR Mix + 5 μL E.coli Primer&probe Mix) + 10 μL DNA-spädningsbuffert. Det rekommenderas att konfigurera tre replikatbrunnar.

5. PCR-reaktionssystem

Tabell 2 Reaktionssystem

^*Beräkna den totala PCR-reaktionsvolymen efter antalet reaktioner: qPCR Mix =(antalet reaktioner+2) × (15+5) μL (inklusive förlusterna av två reaktionsbrunnar). Mer än tre replikat för varje prov rekommenderas i experimentet.

^**Efter att ha täckt röret eller förseglat plattan, centrifugera reaktionsröret eller plattan vid låg hastighet i 10 sekunder. Efter tillräcklig skakning och blandning i 5 sekunder, upprepa centrifugeringen för att samla upp vätskan från locket eller väggen till botten. Undvik bubblor under drift.

Se nedanstående tabell för den rekommenderade plattinställningen:

Tabell 3 Referenskort på dator

Plattlayouten inkluderar: 5 Std (standardkurvan för 5 standardkoncentrationer), 1 NTC (ingen mallkontroll), 1 NCS (negativ kontrolllösning), 3 TS (testprover), 3 ERC (extraktionsåtervinningskontroll).Tre replikatbrunnar för varje prov.

6. Inställning riktlinjer för ett PCR-instrument(2-stegs metod) (t.ex. Thermo ABI 7500 qPCR-instrument, programvara version 2.0）

Följande instruktioner gäller endast för Thermo ABI 7500 qPCR-instrument (programversion 2.0). Om du använder ett annat instrument, se tillämplig instrumentguide för installationsriktlinjer.

1) Skapa ett nytt experiment, välj mallen för absolut kvantifiering eller användardefinierad.

2) Skapa 1 detektionssond, benämnd "E.coli-DNA", välj reporterfluorofor som "FAM" och släck fluorofor som "Ingen". Referensfluorescensen är ROX" (referensfluorescensen kan baseras på instrumentmodellen etc., välj om du behöver lägga till den).

3) I rutan "Sampler" lägger du till all information om prov i tur och ordning. Välj sedan brunnarna, välj målet och proverna på motsvarande sätt. Ställ in uppgiften för E.coli DNA-standard som standard, och tilldela värdena 300000, 30000, 3000, 300, 30 (enheten för DNA-koncentration i varje brunn är fg/μL) i kolumnen Kvantitet och namnge brunnarna Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, på motsvarande sätt. Ställ in uppgiften för NTC som NTC. Ställ in NCS, TS och ERC som Okänd, och namngav dem enligt ovanstående plattlayout på motsvarande sätt. Klicka sedan på nästa.

4) Ställ in amplifieringsprogrammet: ställ in reaktionsvolymen på 30 μL.

Tabell 4 Amplifieringsprocedur

7. Analys av qPCR-resultat

1) Systemet kommer automatiskt att ge analyspanelen Threshold In Amplification Plot. Tröskeln som ges av systemet är ibland för nära baslinjen, vilket resulterar i en stor skillnad i Ct mellan replikatbrunnar. Du kan manuellt justera tröskeln till en lämplig position och klicka på Analysera. Sedan kan du först kontrollera om amplifieringskurvan är normal i Multicomponent Plot.

2) På fliken Resultatanalys granskar du standardkurvans plot. Verifiera värdena för R², Effektivitet, Lutning och Y-intercept. För en normal standardkurva, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Lutning≤-3,1.

3) I rutan 'Visa brunnstabell' i Analys visas koncentrationerna av varje prov i Kvantitet, enheten är fg/μL, enheterna kan konverteras i analysrapporten.

4) Parameterinställningarna för resultatanalysen måste baseras på den specifika modellen och den mjukvaruversion som används och kan i allmänhet tolkas automatiskt av instrumentet.

5) Beräkna spikåtervinningsgraden baserat på testresultaten för provet TS som ska mätas och provets spikåtervinnings-ERC, återhämtningsgraden för spikar måste vara mellan 50%~150%.Formel för mätare för hög återvinningsgrad: Återhämtning (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Elueringsvolym (μL) / Teoretiskt värde för mängden DNA-tillsats (t.ex. pg) x 100 %.

6) Ct-värdet för den negativa kontrollen NCS bör vara större än medelvärdet av den lägsta koncentrationen Ct i standarden.

• Mallfri kontroll NTC bör vara obestämd eller Ct-värde ≥3

Anteckningar

1. Denna produkt är endast avsedd för forskning.
2. Använd labbrockar och engångshandskar för din säkerhet.

3. Läs denna handbok noggrant innan du använder detta reagens, och experimentet bör standardiseras, inklusive provhantering, förberedelse av reaktionssystem och provtillsättning.

4. Se till att varje komponent är helt vortexiserad och centrifugerad vid låg hastighet före användning.

Manuell